H1N2流感病毒从猪向火鸡的跨种传播及其分子适应机制与体外复制特征研究

本刊推荐：为解决H1avN2#E基因型流感病毒从猪向火鸡及人类跨种传播的机制问题，研究人员开展了病毒分子进化与体外复制特征研究，发现HA蛋白220-loop区域的E233K/E236K突变和NA蛋白T401N/S416N突变为火鸡适应关键分子标记，揭示了该病毒在禽类与哺乳动物细胞中的差异化复制能力，对流感病毒跨宿主传播预警具有重要意义。

　　

流感病毒跨物种传播一直是全球公共卫生安全的重要威胁。近年来，在法国猪群中流行的H1_avN2#E基因型流感病毒展现出令人担忧的跨种传播能力——不仅感染了19个火鸡养殖场，还出现了人类感染病例。这种病毒如何突破物种屏障？它在不同宿主中如何适应？这些问题亟需科学解答。

为了揭示H1N2流感病毒的跨种传播机制，法国ANSES实验室的Chloé Chavoix等研究人员开展了系统研究。他们通过对2020-2023年间法国猪群和火鸡群中分离的病毒株进行基因测序和进化分析，结合体外感染实验，深入探索了病毒在跨物种传播过程中的分子适应特征和复制动力学特性。这项研究最近发表在《Virus Research》期刊上。

研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先采用新一代测序技术对137株猪源和19株火鸡源H1_avN2#E病毒的全基因组进行测序；其次利用最大似然法构建系统发育树分析病毒进化关系；通过选择压力分析识别正选择位点；最后使用MDCK、MLE15和A549三种细胞系以及鸡胚模型进行病毒复制动力学实验，比较不同病毒株的复制效率。

3.1. 2020-2023年间火鸡中H1_avN2#E病例的检测

研究发现，在此期间法国共检测到154起火鸡流感疫情，其中19起由H1_avN2#E病毒引起，且全部发生在布列塔尼地区的种火鸡场。系统进化分析显示，19个火鸡病毒序列中，9个散布在猪病毒序列中，表明独立的猪到火鸡传播事件；而另外10个序列形成了独立的"火鸡簇"，提示病毒在火鸡场间发生了二次传播。

3.2. 2020-2023年间法国流行的H1_avN2#E流感病毒氨基酸序列分析

病毒蛋白序列比较发现，HA蛋白的变异最大（最高3.9%的氨基酸差异）。特别值得注意的是，HA蛋白受体结合位点220-loop区域的233和236位点出现了明显的氨基酸频率差异：在猪源病毒中，233位点99.3%为谷氨酸(E)，而在火鸡簇病毒中，40%变为赖氨酸(K)；236位点也出现了类似趋势。NA蛋白的401和416位点也发生了近乎完全的氨基酸替换：火鸡簇病毒100%为天冬酰胺(N)，而猪源病毒主要为苏氨酸(T)和丝氨酸(S)。

3.3. 2020-2023年间法国流行的H1_avN2#E流感病毒的选择压力分析

选择压力分析显示，所有蛋白主要受到纯化选择作用。使用MEME方法在HA蛋白中检测到4个位点(65、86、136和236)存在间歇性正选择。特别值得注意的是，233位点仅在火鸡簇序列中被鉴定为多样化位点，表明该位点可能参与了病毒对火鸡宿主的适应过程。

3.4. 体外实验用三株研究病毒的核苷酸和氨基酸分析

研究人员选择了三株代表性病毒进行后续实验：猪源病毒(Swine virus)、与猪病毒高度相似的火鸡病毒(Turkey swine-like virus)和火鸡簇病毒(Turkey virus)。全基因组比对显示，Turkey virus与Swine virus在4789个氨基酸中有35个差异，其中8个在HA蛋白，5个在NA蛋白。

3.5. 野外样品和病毒培养后序列的比较

值得注意的是，Turkey virus在MDCK细胞上传代后，HA基因出现了K233M和E236G突变，这两个突变恰好位于受体结合位点的220-loop区域，进一步证实了该区域在病毒适应过程中的重要性。

3.6. 细胞复制动力学中的病毒基因组载量和感染滴度

病毒复制实验发现，在MDCK和A549细胞中，低感染复数(MOI=0.001)条件下，Turkey virus产生的感染性病毒粒子最多；而在高感染复数(MOI=0.1)条件下，Turkey swine-like virus产量更高。在MLE15细胞中，三种病毒的复制效率相似，但总体上高MOI条件下的病毒产量高于低MOI条件。

3.7. 鸡胚复制动力学中的病毒基因组载量和感染滴度

在鸡胚模型中，Swine virus和Turkey swine-like virus能有效产生感染性病毒粒子，而Turkey virus的感染性病毒产量极低，这与该病毒在哺乳动物细胞中的高效复制形成鲜明对比。

研究结论与讨论部分指出，这项工作首次系统揭示了H1_avN2#E流感病毒从猪向火鸡传播的分子机制。研究发现，HA蛋白受体结合位点220-loop区域的E233K和E236K突变可能是病毒适应火鸡宿主的关键分子标记，而NA蛋白的T401N和S416N突变也可能是火鸡适应的特征性变异。这些发现为了解流感病毒跨物种传播的分子基础提供了重要见解。

病毒复制实验的结果表明，Turkey virus在哺乳动物细胞中（特别是在低MOI条件下）复制效率更高，而在鸡胚中复制能力较差，这种差异可能反映了病毒在适应新宿主过程中发生的权衡。有趣的是，Turkey virus在细胞培养中迅速出现了位于220-loop的适应性突变，这进一步支持了该区域在宿主适应中的重要性。

从公共卫生角度，这项研究强调了持续监测流感病毒在动物种群中进化的重要性。H1_avN2#E病毒已经显示出能够感染猪、火鸡和人类，其进一步的进化可能会增加对人类的威胁。研究鉴定的分子标记可用于未来监测工作中，帮助识别可能具有更高跨种传播风险的病毒变异。

此外，研究结果对禽流感防控也有重要启示。火鸡作为同时具有α2,3和α2,6连锁唾液酸受体的物种，可能成为流感病毒重组和适应的"混合容器"。加强对火鸡场中流感病毒的监测，特别是那些靠近猪场的火鸡场，对于早期发现和应对潜在的疫情具有重要意义。

这项研究不仅增进了我们对流感病毒跨种传播机制的理解，也为开发针对性的监测和防控策略提供了科学依据。未来研究需要进一步探索鉴定的分子标记功能，并通过体内实验验证这些突变对病毒适应性和传播性的影响，为流感大流行的防范提供更加全面的科学支撑。