靶向中性粒细胞FPR1：源自曲霉菌的丁内酯I（BLI）缓解急性呼吸窘迫综合征的新机制

本研究针对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）缺乏有效治疗药物的临床难题，揭示了源自土曲霉的天然化合物丁内酯I（BLI）通过特异性阻断甲酰肽受体1（FPR1）抑制中性粒细胞过度激活的作用机制。研究人员通过分子对接、受体结合实验及体内外模型证实，BLI能显著抑制FPR1介导的超氧阴离子（O2•-）产生、弹性蛋白酶释放、CD11b表达和细胞迁移，并减轻小鼠LPS诱导的ARDS肺部病理损伤。该发现为开发靶向FPR1的ARDS治疗策略提供了重要实验依据。

　　

在重症医学领域，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）始终是威胁生命的重大临床挑战，尤其在新冠肺炎（COVID-19）大流行中，它更是导致患者死亡的主要并发症之一。这种疾病的病理核心在于肺部过度且失控的炎症反应，而中性粒细胞作为先天免疫系统的“先锋部队”，在其中扮演了关键角色。当感染或组织损伤发生时，中性粒细胞会迅速聚集到肺部，通过释放活性氧（ROS）、弹性蛋白酶等炎性介质来清除病原体，但过度的激活反而会损伤肺组织，加剧病情。其中，一种名为甲酰肽受体1（FPR1）的蛋白质尤为关键，它能被细菌或受损线粒体释放的N-甲酰肽激活，进而触发中性粒细胞的一系列炎症反应。然而，目前临床上仍缺乏能特异性抑制FPR1的有效药物，这也成为治疗ARDS的一个突破口。

正是在这一背景下，研究者将目光投向了天然产物。真菌次级代谢产物一直是药物发现的重要来源，其中，土曲霉（Aspergillus terreus）产生的丁内酯I（Butyrolactone I, BLI）因其多样的生物活性（如抗炎、抗氧化）引起了团队的兴趣。但BLI是否能够调控中性粒细胞功能，特别是通过FPR1影响ARDS进程，尚属未知。为了回答这一问题，来自中国台湾长庚纪念医院麻醉科的研究团队开展了一系列实验，并将成果发表在《Biochemical Pharmacology》上。

研究主要采用了以下关键技术方法：从健康志愿者外周血中分离纯化人类中性粒细胞进行体外功能实验；通过FPR1激动剂（如fMLF、fMMYALF）刺激细胞，检测BLI对超氧阴离子产生、弹性蛋白酶释放、CD11b表达和细胞迁移的抑制作用；利用流式细胞术进行受体结合实验，分析BLI与FPR1的结合竞争；采用分子对接模拟BLI与FPR1蛋白（PDB ID: 7EUO）的结合模式；通过蛋白质免疫印迹（Western blot）分析BLI对FPR1下游信号通路（Akt、JNK、ERK、p38 MAPK）磷酸化的影响；使用小鼠LPS气道注射诱导ARDS模型，进行组织病理学和免疫组化分析，评估BLI的体内治疗效果。

3.1. BLI选择性抑制FPR1激动剂诱导的超氧阴离子产生和弹性蛋白酶释放

研究人员首先发现，BLI能浓度依赖性地抑制由FPR1特异性激动剂（fMLF和fMMYALF）激活的中性粒细胞产生活性氧主要成分——超氧阴离子（O₂^•-），其半抑制浓度（IC₅₀）分别为1.93 μM和1.45 μM。值得注意的是，BLI对由非FPR1激活剂（如PMA）诱导的产生活性氧则无显著抑制作用，体现了其作用的选择性。同样，BLI也能显著抑制FPR1激动剂诱导的另一种关键炎症介质——弹性蛋白酶的释放。进一步的实验排除了BLI直接清除超氧阴离子或抑制弹性蛋白酶活性的可能性，且细胞毒性实验证实，即使在高达60 μM的浓度下，BLI也不会导致中性粒细胞裂解（LDH释放未增加）。这些结果表明，BLI的抗炎作用是通过特异性抑制FPR1的激活通路而非直接解毒或细胞毒性实现的。

3.2. BLI减少FPR1激活的中性粒细胞CD11b表达和趋化迁移

中性粒细胞从血管迁移到炎症部位的过程需要其表面粘附分子CD11b的参与。流式细胞术分析显示，BLI预处理能显著降低由fMLF或fMMYALF刺激引起的CD11b表达上调。然而，对于由PMA（非FPR1激活剂）引起的CD11b表达，BLI则无影响。在Boyden小室趋化实验中，BLI同样有效抑制了fMLF诱导的中性粒细胞迁移。这些发现说明，BLI通过靶向FPR1，抑制了中性粒细胞向炎症部位的招募和粘附，这是缓解炎症的关键一步。

3.3. BLI阻断FPR1而非FPR2的结合

为了直接证实BLI的作用靶点，研究团队进行了受体结合竞争实验。他们使用FPR1的特异性荧光配体FNLFNYK，发现BLI能浓度依赖性地抑制该配体与中性粒细胞、分化后的THP-1细胞以及过表达人FPR1的HEK-293细胞的结合。相比之下，对于FPR2的特异性荧光配体MMK-1F，BLI即使在高浓度下也几乎不能抑制其结合（FPR2的特异性拮抗剂WRW4则能有效抑制）。这强有力地证明，BLI是一个选择性的FPR1拮抗剂。

3.4. BLI与FPR1结合位点的相互作用分析

分子对接模拟将BLI与FPR1的结合机制可视化。分析表明，BLI能够很好地嵌入FPR1的正电荷结合口袋中，该口袋是短链N-甲酰肽的经典结合位点。BLI分子中的多个部位通过氢键与FPR1的关键氨基酸残基（如D106、R201、R205、Y257）相互作用，其芳香环和长碳链则与F33、F81、F102等残基形成疏水相互作用。这种多模式的结合方式使得BLI能稳定地占据FPR1的配体结合位点，从而有效阻断内源性激动剂的激活。

3.5. BLI的自由基清除活性

除了受体拮抗作用，BLI还展现出额外的抗氧化潜能。在细胞实验中，BLI能抑制fMLF和PMA刺激引起的细胞内ROS水平升高。在无细胞体系中，BLI表现出浓度依赖性的活性氮物种（RNS）清除能力（通过DPPH和ABTS实验验证）和活性氧物种（ROS）清除能力（通过氧自由基吸收能力ORAC实验验证）。这表明BLI可通过“抑制产生”和“加速清除”双重途径减轻氧化应激损伤。

3.6. BLI减少ROS依赖的NETs形成

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成是中性粒细胞的一种特殊免疫功能，但其过度形成会加剧组织损伤。研究发现，BLI预处理能显著减少由PMA（一种强ROS诱导剂）刺激引起的NETs形成（通过共聚焦显微镜观察中性粒细胞弹性蛋白酶和瓜氨酸化组蛋白H3（Cit-H3）与DNA的共定位）。这进一步印证了BLI通过抑制ROS来调控中性粒细胞的功能。

3.7. BLI减少Ca²⁺动员和激酶磷酸化

钙离子（Ca²⁺） mobilization是FPR1激活后的早期核心事件。BLI能有效抑制fMLF引起的细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]_i）升高，但对其他激动剂（如FPR2激动剂MMK-1）引起的钙响应则无影响。进一步地，Western blot实验表明，BLI能抑制fMLF激活引起的下游关键信号蛋白的磷酸化，包括Akt、JNK、ERK和p38 MAPK。这些结果从信号转导层面阐明，BLI通过阻断FPR1，抑制了其下游的G蛋白-Ca²⁺和MAPK/Akt信号通路。

3.8. BLI减轻LPS诱导的小鼠肺损伤

最后，研究在LPS气道灌注诱导的小鼠ARDS模型中验证了BLI的体内治疗效果。组织病理学（H&E染色）显示，BLI预处理显著减轻了LPS引起的肺泡壁肿胀、出血和炎症细胞浸润。免疫组化分析进一步表明，BLI治疗降低了肺部中性粒细胞标志物（Ly6G和MPO）的表达、减少了弹性蛋白酶和氧化损伤标志物（4-HNE）的沉积，并下调了关键促炎细胞因子IL-1β的水平。这些结果充分证明，BLI通过抑制FPR1和中性粒细胞介导的炎症，有效缓解了ARDS的肺部病理损伤。

结论与意义

本研究系统阐明了真菌代谢产物丁内酯I（BLI）作为一种新型、选择性FPR1拮抗剂，在体外和体内模型中缓解急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的作用和机制。其重要意义体现在以下几个方面：首先，它发现了一种源自天然产物的FPR1抑制剂，为开发靶向FPR1的治疗药物提供了新的先导化合物。其次，BLI的作用具有多重性：既能特异性拮抗FPR1受体，抑制中性粒细胞的过度激活（呼吸爆发、脱颗粒、粘附、迁移），又具备自由基清除能力，还能抑制ROS依赖的NETosis，从而从多个环节打断炎症-氧化应激恶性循环。最后，在LPS诱导的ARDS小鼠模型中，BLI展现出明确的肺部保护作用，显著降低了中性粒细胞浸润、氧化损伤和炎症因子水平，验证了其治疗潜力。尽管BLI已知的CDK抑制活性在本研究中未观察到细胞毒性效应，但其在抗炎中是否扮演辅助角色值得进一步探索。总之，该研究不仅深化了对FPR1在中性粒细胞炎症中作用的理解，也为治疗ARDS、COVID-19相关肺炎等中性粒细胞驱动性疾病提供了新的策略和候选分子。