靶向VCP、NETs及双重免疫检查点的TME响应型纳米粒协同重塑EGFR/PD-L1/CTLA-4驱动型结直肠癌的免疫微环境

本研究针对结直肠癌免疫逃逸和转移难题，开发了pH响应型正交掩蔽PEG包被的固体脂质纳米粒(SLNs)，共递送VCP/p97抑制剂NMS-873(NM)和PD-L1/CTLA-4双特异性适体(P1C4)，同步装载NET降解酶DNase(DN)和TGF-β抑制剂galunisertib(G)，通过多肽引导靶向EGFR/PD-L1/CXCR2，实现内质网应激诱导、免疫检查点阻断和NET清除的协同治疗，显著抑制肿瘤生长并重塑免疫抑制微环境。

　　

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。其进展受到广泛转移、复发、肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）内的免疫逃逸以及对致癌基因靶向治疗的耐药性的加剧。内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ERS）因蛋白质稳态受损而失调，与CRC的进展相关。含缬酪肽蛋白（Valosin-Containing Protein, VCP/p97）作为蛋白质稳态的主要调节因子，控制泛素依赖的蛋白酶体降解，因此靶向VCP/p97成为诱导ERS、抑制肿瘤进展和克服免疫逃逸的有前景策略。NMS-873（NM）是一种有效的VCP变构抑制剂，通过破坏ATP非依赖性底物处理并诱导蛋白质稳态崩溃，从而引发广泛的抗癌效应。然而，NM的溶解性差、生物利用度有限和毒性问题限制了其临床应用，因此需要创新的递送策略。纳米颗粒为基础的组合免疫疗法可能应对这些挑战并改善治疗效果。

CRC免疫治疗的一个主要临床障碍是肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）和中性粒细胞（Tumor-Associated Neutrophils, TANs）上PD-L1的悖论性过表达，尽管CRC细胞上的PD-L1表达较低。同时，靶向CTLA-4——一种通过隔离CD80/CD86来减弱T细胞激活的免疫检查点——对于恢复早期免疫反应仍然至关重要。双特异性适体P1C4能够同时结合PD-L1和CTLA-4，提供了一种双重靶向模式，将T细胞毒性重定向至TME中的肿瘤细胞和抑制性髓系亚群。与抗体相比，P1C4表现出较低的免疫原性、更好的组织渗透性和更高的生产效率，同时实现了卓越的杀瘤和免疫激活功效。此外，中和TANs和TAMs（转移和不良结果的关键驱动因素）的策略对于改善临床转化至关重要。TANs通过分泌中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）和白细胞三烯介导远端传播，而NETs形成屏障阻碍CD8⁺ T细胞和NK细胞浸润。NET形成依赖于中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase, NE）和髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）的酶活性，这使得它们成为这一过程的关键介质和潜在治疗靶点。脱氧核糖核酸酶（DNase; DN）是一种被批准用于囊性纤维化的酶，并广泛用于临床前模型中的NET降解，作为免疫佐剂被纳入以 dismantle NET结构并促进抗肿瘤免疫反应。然而，P1C4和DN的不稳定性和全身毒性需要精确的递送策略以改善治疗效果并减少脱靶效应。为了进一步破坏TME驱动的免疫抑制，galunisertib（G）（一种TGF-β受体I抑制剂）被用于阻断TGF-β介导的TAN招募、肿瘤进展和耐药性。G的纳米制剂对于减轻与全身暴露相关的心脏毒性并改善其药理学特性至关重要。

为了开展这项研究，研究人员采用了多项关键技术方法：通过¹H NMR和MALDI-TOF MS验证了DSPE-omPEG和DSPE-PEG-多肽缀合物的成功合成；使用Zetasizer Nano-ZS分析仪和透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）表征了纳米粒的粒径、多分散指数（Polydispersity Index, PDI）、zeta电位和形态；通过超速离心和UV/VIS分光光度法测定了封装效率（Encapsulation Efficiency, EE%）和药物负载效率（Drug Loading Efficiency, DL%）；利用流式细胞术（Flow Cytometry）和共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）评估了细胞摄取和细胞内定位；通过蛋白质印迹（Western Blot）分析了ERS、EMT、CSC、细胞周期和凋亡相关蛋白的表达；采用伤口愈合实验检测细胞迁移；通过ELISA试剂盒定量分泌的细胞因子；利用流式细胞术分析了体外和体内（来自CT26荷瘤小鼠的肿瘤和脾脏）免疫细胞群体；通过PET/MRI成像监测体内肿瘤分布；通过苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, HE）染色、免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）和TUNEL assay评估组织病理学和凋亡；并通过自动化临床化学分析仪和血液学分析仪评估了生物安全性。研究中使用的细胞系包括鼠源结肠癌CT26细胞、人源结肠癌HCT116细胞、人单核白血病THP-1细胞、人早幼粒白血病HL-60细胞、人T淋巴细胞Jurkat细胞、CT26来源的癌症干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）以及大鼠肠上皮IEC-6细胞。

3.1. P1C4+NM/SLN-AOV和DN+G/SLN-BO纳米制剂成功合成并通过NMR和质谱验证

研究成功合成了DSPE-PEG与A、B、O、V肽的缀合物，并通过MALDI-TOF MS验证。DSPE-omPEG中pH敏感的亚胺键（CH=N）通过¹H NMR在9.38 ppm的质子信号得到确认。P1C4+NM/SLN-AOV和DN+G/SLN-BO的纳米颗粒尺寸在100-200 nm范围内，具有可靠的PDI。包被pH敏感的omPEG在生理pH下增加了纳米颗粒尺寸，而在酸性pH 6.0下，omPEG脱落，尺寸恢复到未屏蔽时的值。所有SLN制剂均显示出正zeta电位（>20 mV），高EE%（>85%）和显著的DL%（>20%）。TEM图像证实了球形结构和单分散分布。

3.2. omPEG包被的纳米制剂显示肿瘤pH响应性脱落，实现持续 cargo释放和增强的细胞内化

体外释放分析表明，在生理pH（7.4）下，NM和P1C4从各种制剂中缓慢释放，而在酸性pH 6.0下，P1C4+NM/omSLN-AOV中P1C4和NM的释放显著加速。流式细胞术显示，与游离对应物相比，DiI-NM/SLN-AOV和FITC-P1C4/SLN-AOV的细胞摄取增加，并且在酸性条件（pH 6.0）下，DiI-NM/omSLN-AOV和FITC-P1C4/omSLN-AOV的摄取最高，表明pH依赖性细胞内化。CLSM显示DiI-NM/SLN-AOV（红色）在30分钟内与EGFR（白色）共定位，证实了A肽特异性靶向EGFR；类似地，与PD-L1（白色）共定位证明了V肽靶向PD-L1的能力。DiI-NM/SLN-AOV（红色）的细胞内运输显示，在3小时内，它逐渐从细胞外围迁移到ER（绿色），到24小时，观察到显著的ER积累，产生黄色信号，表明有效的内化和选择性靶向。使用靶向中性粒细胞上CXCR2的B肽，DN+DiI-G/SLN-BO在30分钟内快速定位于中性粒细胞表面，并在3小时内向ER分布。这些发现揭示了肽修饰的SLNs在靶向CRC细胞、TAMs/TANs和ER方面的精确性。

3.3. 联合纳米制剂通过VCP/p97抑制引发ERS驱动的细胞周期阻滞和凋亡，有效抑制CSC和EMT

蛋白质印迹分析显示，NM诱导ERS标志物（Bip, ATF6, p-IRE1α, XBP1, JNK, p-PERK, p-eIF2α, ATF4, CHOP）上调，NM/SLN-AOV进一步升高，而P1C4+NM/SLN-AOV最为显著，表明强效的ERS诱导。联合制剂显著抑制了间充质标志物（N-cadherin, Slug, Snail, Smad）和CSC相关因子（CD44, Oct4, Nanog, c-Myc）以及侵袭效应物MMP-9，同时恢复了E-cadherin表达，共同反映了EMT和CSC表型的显著减弱。一致地，VCP抑制 combined with dual blockade of PD-L1 and CTLA-4显著减少了伤口闭合，表明迁移能力受损和EMT-和CSC相关特性的功能抑制。P1C4+NM/SLN-AOV诱导G1期阻滞。此外，癌症相关细胞周期调节因子如FBXO5, CDC20, RRM2, cyclin D1, GMNN, and PTTG1的表达在联合治疗后显著降低。细胞死亡增加和促凋亡蛋白（Bak, Bim, cleaved Caspase 3）上调同时抗凋亡Bcl-2下调被检测到，支持凋亡诱导。这些结果强调了NM/SLN-AOV，特别是与P1C4/SLN-AOV协作，在同时触发细胞周期阻滞和凋亡方面的强效功效。

3.4. 联合纳米制剂通过NM增强ERS和通过P1C4、G和DN激活免疫反应来增强ICD

损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs）的释放，包括ATP、HMGB1和CRT，是ICD的一个定义特征，显著增强免疫识别和激活。CLSM成像显示，在P1C4和/或NM组中，HMGB1和CRT有明显的红色染色，在P1C4+NM/SLN-AOV组中染色最强烈。此外，ATP释放测定显示，细胞外ATP分泌更高，细胞内ATP水平更低，特别是在联合治疗组中。

3.5. 集成纳米药物通过抑制NETs、阻断PD-L1/CTLA-4和调节细胞因子产生来增强T细胞介导的抗肿瘤 immunity

为了对抗TGF-β和NET介导的肿瘤进展和免疫抑制，DN（一种降解NETs的DNA切割酶）与G（一种抑制TAMs和TANs的TGF-β抑制剂）配对。这种共制剂比单一疗法更明显地减少了NETs。DN+G/SLN-BO在抑制NETs方面表现出优于DN/SLN-BO或G/SLN-BO alone的功效，巩固了其作为NET调节最有效制剂的地位。虽然P1C4+NM/SLN-AOV有效减少了NET形成，但加入DN+G/SLN-BO进一步加强了这种效果，证实了DN和G在协调TAN-NET动力学中的关键作用。使用HCT116细胞与Jurkat和THP-1细胞共培养来检查肿瘤-免疫相互作用，对靶向PD-L1和CTLA-4的各种适体和抗体的评估表明，P1C4适体相对于其抗体或适体对应物 exerts the most substantial suppressive effect。FITC标记的P1C4对HCT116细胞和T细胞表现出结合亲和力。蛋白质印迹分析证实P1C4/SLN-AOV和P1C4+NM/SLN-AOV有效下调了PD-L1和CTLA-4表达，表明能够调节肿瘤细胞信号和免疫激活的双重检查点干扰。CFSE测定（细胞增殖的敏感指标）显示，P1C4/SLN-AOV治疗后T细胞群体显著扩增，由于连续分裂，荧光强度下降了75%。ELISA证明促炎细胞因子TNF-α和IL-2水平升高，抗炎TGF-β和IL-10水平降低。这些体外筛选表明，P1C4+NM/SLN-AOV与DN+G/SLN-BO的组合刺激了 superior immune responses，归因于ERS、PD-L1、CTLA-4、TGF-β、TAMs、TANs和NETs的协调调节。

3.6. 集成纳米载体在CT26荷瘤小鼠中引发强效抗肿瘤 immunity并重新配置免疫抑制性TME，通过促进效应T细胞浸润、增强DC成熟和减轻Treg/TAM群体

体内研究显示，虽然体重在各组间相当，但肿瘤大小差异显著。PET/MRI成像证实了P1C4+NM/SLN-AOV和DN+G/SLN-BO的强效治疗效果。在P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO中加入pH敏感的omPEG导致比未包被对应物更小的肿瘤，表明omPEG屏蔽保护了肿瘤靶向肽，从而改善了酸性TME内的瘤内递送和治疗效果。TUNEL染色显示，在P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO组中，凋亡显著增加，HE染色显示核固缩（核收缩和染色质凝聚）。这些 treatments elicited the most pronounced apoptotic activity and conferred the greatest antitumor efficacy。肿瘤和脾脏来源的免疫细胞的流式细胞术免疫表型分析显示，治疗后DCs、CD8⁺细胞毒性T细胞和CD4⁺辅助T细胞的激活增强，特别是在P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO组中。同时，与对照组相比，所有组的Treg（FoxP3⁺CD25⁺）和TAM（F4/80⁺CD206⁺）群体减少，在P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO组中观察到最强的反应。补充性IHC分析证实了肿瘤组织内辅助性和细胞毒性T细胞增加，以及Tregs和PD-L1/CTLA-4表达减少。

3.7. 多功能纳米制剂重编程TAMs并扩增效应记忆T细胞，在CT26荷瘤小鼠中促进持久的免疫记忆

再攻击实验通过在第14天初次切除后在对侧腹壁重新植入肿瘤来评估免疫记忆。经过7天的洗脱期后，肿瘤细胞被重新植入左腹壁并生长7天。肿瘤大小和重量被监测了两周。体重在各组间没有显著变化，而通过omSLN-AOV或omSLN-BO递送的P1C4+NM和DN+G产生了显著的肿瘤消退。这些组合还引起了效应记忆T细胞（CD44⁺CD62L^?）的明显扩增，标志着强效和持久的免疫记忆反应。用P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO治疗刺激了促炎细胞因子的显著升高，包括IL-1α、IL-2、IL-9和IL-12。重要的是，用P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO治疗导致免疫抑制细胞因子IL-4、IL-5和IL-10的血清水平显著降低。简而言之，P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO治疗通过增强促炎细胞因子产生和降低免疫抑制细胞因子水平，巧妙地重新配置了TME，从而最终产生良好的抗肿瘤效果。

3.8. TAN靶向纳米制剂重塑中性粒细胞极化并抑制NET形成以增强CRC荷瘤小鼠的抗肿瘤 immunity

中性粒细胞亚群分析显示，在P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO组中，明显转向抗肿瘤发生的N1表型，其特征是N1中性粒细胞显著增加和N2中性粒细胞减少。这种集成制剂明显抑制了NET形成，如减弱的NE和MPO染色所证明。CLSM和SEM成像表明，在对照组（CTR）中存在广泛的NET网络，而各种治疗组诱导了不同的结构改变，网状网络碎片化并转移到外围。在P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO组中，中性粒细胞主要恢复了圆形形态，显示出N1表型的特征性超分叶核。SYTOX Green定量（标准化为中性粒细胞计数）证实了NET形成的显著减轻，特别是在含有DN+G/SLN-BO的联合治疗组中，无论是否有omPEG包被。相应地，Cit-H3（一个关键的NET标志物）显著减少。MPO（白色）和Cit-H3（红色）的免疫荧光染色进一步验证了NET抑制，在组合治疗中观察到最显著的减少。通过保留B肽的TAN靶向功能并确保DN和G的精确递送，omPEG层增强了DN+G/SLN-BO的治疗效力，促进了NET降解并放大了组合方案的抗肿瘤功效。

3.9. omPEG纳米制剂改善了正常细胞、免疫细胞和癌细胞以及荷瘤小鼠的生物安全性：细胞毒性、溶血、体重、生化测试、组织病理学和组织分布的评估

体外细胞毒性测定表明，NM、DN和G在正常IEC-6、免疫HL-60和Jurkat细胞以及CRC CT-26细胞中诱导细胞死亡，而omPEG包被的SLNs在酸性条件（pH 6.0）下赋予肿瘤选择性细胞毒性，在正常和免疫细胞中毒性降低。监测体重作为实用的体内安全指标。所有组在整个治疗期间保持稳定的体重，没有显著损失，表明与 tested formulations相关的全身毒性最小。此外，体内生物安全性评估显示稳定的血液学指标，除了血小板（PLT）计数有轻微、临床可忽略的升高。肾脏和心脏标志物（BUN, CRE, CKMB）保持在正常范围内。尽管长期G暴露与心脏毒性有关，但本研究中的短期给药未引起 adverse cardiac effects。在NM和P1C4组中，GOT和GPT升高表明肝毒性，这在有或没有omPEG包被的SLN AOV和SLN BO制剂中都得到了缓和。这些发现得到了H&E组织病理学的支持，它证实了游离药物组中的轻度肝损伤，但心脏或肾脏组织中没有结构损伤。生物分布研究证实了NM纳米制剂的肿瘤选择性积累，P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO实现了最大的肿瘤特异性。omPEG的加入减少了对脱靶器官的非特异性分布，而靶向肽促进了肿瘤识别、渗透和内化，从而证实了P1C4+NM/omSLN-AOV和DN+G/omSLN-BO在肿瘤、TAMs和/或TANs中的选择性积累。总的来说，体重的维持、血液学和生化参数的稳定性、非靶组织中组织病理学损伤的缺失以及优先的肿瘤积累证实了omPEG-和肽修饰的纳米制剂的良好生物安全性和转化潜力。

本研究开发的肽修饰、omPEG屏蔽的SLNs代表了一种转化上引人注目的方法，用于重新连接免疫耐受并重新敏感EGFR/PD-L1/CTLA-4驱动的CRC和其他顽固性肿瘤，为下一代免疫纳米医学奠定了基础。该策略汇聚了多种机制——凋亡、ICD、EMT抑制、CSC破坏和NET清除——到一个统一的、TME响应性的递送平台。通过整合VCP拮抗作用、双特异性适体引导的免疫检查点靶向以及用于TGF-β阻断和NET消融的双重免疫佐剂，克服了对常规化学免疫治疗的耐药性，并在检查点失调的环境中 revitalizes antitumor immunity。总之，这些肽修饰的、omPEG屏蔽的SLNs代表了一种转化上引人注目的方法，用于重新连接免疫耐受并重新敏感EGFR/PD-L1/CTLA-4驱动的CRC和其他顽固性肿瘤，为下一代免疫纳米医学奠定了基础。