基于诱导型FLP-FRT系统的圆红酵母代谢工程改造及玉米秸秆水解液高效生产3-羟基丙酸研究

本刊推荐：本研究通过开发合成型诱导启动子（tet/lac）调控的FLP-FRT（flippase recognition target）系统，实现了圆红酵母（Rhodosporidium toruloides）无标记基因组编辑。应用该技术对3-羟基丙酸（3HP）生物合成途径进行四轮迭代优化，最终在补料分批发酵中获得69.4 g/L的3HP产量（当前酵母体系最高纪录）。该工作为木质纤维素生物质的高值化利用提供了创新性技术平台。

　　

Highlight

菌株与质粒

本研究使用的野生型圆红酵母IFO0880及其KU70缺失株系源自前期研究（Zhang et al., 2016a）。根癌农杆菌菌株用于农杆菌介导的转化（ATMT），NEB5-alpha菌株（New England Biolabs, Ipswich, USA）用于质粒克隆与保存。FLP重组酶、四环素阻遏蛋白（TetR）、malonyl-CoA还原酶（MCR）及methylmalonyl-CoA羧基转移酶基因均通过密码子优化合成。

圆红酵母合成诱导型启动子的表征

我们通过在内源强效ANT启动子中插入tet操纵子（TetO）或lac操纵子（LacO），分别构建了合成型启动子ANT1tetO和ANT1lacO（图1A）。为实现严格抑制，将TetR或lac阻遏蛋白（LacR）置于GAPDH启动子控制下（图1A）。随后使用ANT、ANT1tetO和ANT1lacO启动子调控GFP报告基因表达（图1A）。这些构建体通过农杆菌介导转化整合到圆红酵母基因组中。通过流式细胞术检测GFP荧光强度，发现组成型ANT启动子驱动下的荧光强度最高。在未诱导状态下，ANT1tetO和ANT1lacO启动子活性被显著抑制，荧光强度分别降低至ANT启动子的9.9%和9.6%。加入诱导剂（四环素或IPTG）后，ANT1tetO和ANT1lacO启动子活性分别提升10.1倍和10.4倍，展现出优异的诱导特性与动态范围。

结论

本研究成功在圆红酵母中开发了诱导型FLP-FRT标记回收系统，并通过迭代式菌株工程优化了3HP生产。研究结果表明：通过表达MCR突变体、过表达citrate-acetyl-CoA途径、引入异源乙酰辅酶A羧基化旁路酶等策略，可显著提升3HP滴度与产率。最终工程菌株在玉米秸秆水解液补料分批发酵中达到69.4 g/L的3HP产量，为木质纤维素生物质生产生物基化学品提供了高性能平台。