Erianin通过靶向CALM1/CAMKK2激活自噬逆转结直肠癌5-FU耐药性的机制研究

本研究针对结直肠癌(CRC)中5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药这一临床难题，揭示了天然化合物Erianin通过直接结合钙调蛋白1(CALM1)并激活CAMKK2-AMPK信号轴，诱导保护性自噬向细胞毒性自噬转换，从而有效逆转5-FU耐药性的新颖机制。该研究为克服CRC化疗耐药提供了双药联用的治疗策略，具有重要的临床转化价值。

　　

在结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的治疗战场上，5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil, 5-FU）长期以来一直是化疗方案的基石药物。然而，高达90%的患者最终会产生先天或获得性耐药，导致治疗失败和肿瘤复发。这种耐药性如同一道坚固的屏障，让常规化疗手段难以突破。更棘手的是，肿瘤细胞通过激活多种生存信号通路和改变代谢状态，构建了复杂的耐药网络，使得单一靶向治疗往往难以奏效。

近年来，传统中药和天然产物因其多靶点、低毒性的特点，在肿瘤治疗领域展现出独特优势。其中，从金钗石斛（Dendrobium chrysotoxum Lindl）中提取的天然联苄类化合物Erianin，已被报道在肺癌、肝细胞癌和黑色素瘤等多种恶性肿瘤中表现出显著抗肿瘤活性。但它在5-FU耐药的结直肠癌中能否破局，其作用机制又如何，仍是一个待解的谜题。

自噬（Autophagy）作为细胞在应激状态下的一种自我消化过程，在肿瘤发展中扮演着双重角色：一方面，它可以帮助肿瘤细胞清除受损细胞器，在营养缺乏或化疗压力下维持生存；另一方面，过度激活的自噬又会引发II型程序性细胞死亡。这种"双刃剑"特性使得靶向自噬成为逆转化疗耐药的新思路，但其精确调控机制仍有待阐明。

为了解开这些谜团，华中科技大学同济医学院附属协和医院临床营养科的研究团队开展了这项深入研究。他们发现Erianin能显著抑制5-FU耐药CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并通过定量分析证实Erianin与5-FU具有强协同作用（协同指数CI<0.9）。更重要的是，研究揭示了Erianin直接靶向钙调蛋白1（Calmodulin 1, CALM1）并增强其蛋白稳定性，进而激活下游CAMKK2-AMPK信号通路，诱导线粒体自噬（Mitophagy）最终导致细胞死亡的全新机制。

这项研究采用多学科交叉方法，主要关键技术包括：基于GeneCards和SwissTargetPrediction数据库的靶点筛选、分子对接模拟（Autodock Vina）、细胞活力检测（CCK-8法）、协同指数分析（Chou-Talalay法）、蛋白质稳定性试验（环己酰亚胺CHX追踪）、免疫共沉淀（Co-IP）、Western blotting、免疫荧光染色、以及裸鼠异种移植模型。研究使用的细胞系包括人CRC细胞系（HCT116、SW480、RKO、LoVo）和正常结肠细胞系NCM460，均来自标准细胞库。

研究结果方面：

3.1. Erianin抑制5-FU耐药CRC细胞的增殖、侵袭和迁移

通过逐步浓度递增法成功建立5-FU耐药细胞系（SW480/5-FU和RKO/5-FU），其耐药指数（RI）均>10。Erianin对耐药细胞显示出良好选择性（选择性指数SI>7），与5-FU联用产生强协同效应。功能实验表明联合处理显著抑制EdU掺入、伤口愈合和Transwell侵袭能力。

3.2. Erianin靶向CALM1并促进其蛋白稳定性

生物信息学筛选发现CALM1是Erianin的潜在作用靶点。分子对接显示二者结合能为-6.8 kcal/mol。实验证实Erianin通过抑制蛋白酶体降解途径延长CALM1蛋白半衰期，但不影响其mRNA水平。

3.3. CALM1介导Erianin在5-FU耐药CRC细胞中的治疗 efficacy

体内实验表明，CALM1敲除显著减弱Erianin对移植瘤生长的抑制作用，并逆转Erianin对Ki-67和CD31表达的下调效应。安全性评估显示Erianin单用未引起明显体重下降和器官损伤。

3.4. Erianin激活CALM1/CAMKK2通路抑制肿瘤发生

Co-IP实验证明Erianin增强CALM1与CAMKK2的结合。Western blot显示Erianin促进CAMKK2、AMPK和CAMK1磷酸化，该效应可被CAMKK2抑制剂STO-609逆转。功能回复实验证实STO-609部分解除Erianin对增殖和迁移的抑制。

3.5. Erianin通过促进CALM1/CAMKK2介导的自噬抑制5-FU耐药CRC细胞

死亡通路抑制实验表明自噬抑制剂氯喹（Chloroquine, CQ）特异性阻断Erianin的细胞毒性作用。Erianin处理增加LC3B-II/I比值并降低p62蛋白水平，该效应在加用CQ或STO-609时被逆转，证实通过CALM1/CAMKK2通路激活完整自噬流。

研究结论与讨论部分强调，该研究首次阐明Erianin通过靶向CALM1-CAMKK2信号轴调控自噬flux逆转5-FU耐药性的分子机制。CALM1作为钙信号传导的关键传感器，其与Erianin的结合引发了一系列级联反应：增强的CALM1稳定性促进CAMKK2磷酸化，进而激活AMPK和CAMK1，最终将保护性自噬转换为细胞毒性自噬。这种机制创新性地将钙信号传导与自噬调控联系起来，为克服化疗耐药提供了新视角。

研究的临床意义在于：首先，Erianin与5-FU的协同作用为临床联合用药提供了精确的剂量参考（通过CI值定量确定）；其次，CALM1/CAMKK2信号通路可作为预测治疗反应的生物标志物；最后，该研究为天然产物作为化疗增敏剂的开发提供了范式。需要注意的是，虽然研究揭示了自噬的主导作用，但Erianin是否影响其他耐药机制（如药物外排泵或DNA修复）仍需进一步探索。此外，研究使用的细胞系模型虽然能较好模拟耐药表型，但未来需要利用患者来源类器官（PDO）等更接近临床的模型进行验证。

总之，这项研究不仅为克服结直肠癌5-FU耐药提供了新的治疗策略，也深化了我们对钙信号-自噬交叉对话在化疗耐药中作用的理解，为开发靶向CALM1的天然抗肿瘤药物奠定了坚实的理论基础。