神经丝蛋白中链(NfM)检测方法的建立及其在神经退行性疾病中的诊断价值与应用分析

本刊推荐：为解决神经丝蛋白中链(NfM)缺乏定量检测方法的问题，研究人员开发了一种高灵敏度的内源性NfM检测技术，并在肌萎缩侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆(FTD)和路易体痴呆(LBD)等疾病中系统比较了NfM、NfL和NfH的诊断性能。研究发现NfM与NfL高度相关(r=0.93)，且在区分ALS与对照组时表现出优异诊断效能(AUC=0.95)。该研究为神经退行性疾病的生物标志物研究提供了新的重要工具。

　　

在神经科学领域，寻找能够准确反映神经系统损伤的生物标志物一直是研究人员关注的焦点。神经丝蛋白(Neurofilaments)作为神经元轴突的核心结构蛋白，其不同亚型——神经丝蛋白轻链(NfL)、中链(NfM)和重链(NfH)——在神经退行性疾病中表现出巨大的诊断潜力。然而，由于技术限制，NfM的研究远远落后于其他两个亚型，缺乏灵敏特异的定量检测方法阻碍了科学家对其在疾病中作用的深入探索。

在这项发表于《eBioMedicine》的研究中，来自德国乌尔姆大学医院的Badrieh Fazeli、Steffen Halbgebauer等研究人员开展了一项开创性工作。他们成功开发了一种高灵敏度的内部酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，首次实现了对脑脊液中NfM蛋白的精确量化，并在包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆(FTD)和路易体痴呆(LBD)在内的多种神经退行性疾病中进行了系统性的比较分析。

研究团队采用的主要技术方法包括：自主研发的NfM sandwich ELISA检测技术的建立与验证；使用商业化Ella微流体检测系统平行测量NfL和NfH水平；收集和分析305名参与者（包括91名ALS、59名AD、38名FTD、18名LBD患者和99名对照）的脑脊液样本；通过受试者工作特征(ROC)曲线分析评估诊断性能；采用Spearman相关性分析探究各神经丝蛋白之间的关联。

Performance of the established ELISA assay for the detection of NfM

研究人员开发的NfM检测方法表现出优异的性能指标。该方法针对全长重组NfM蛋白，室内和室间变异系数分别为5.5%和10%，定量下限(LLOQ)和检测限(LOD)分别为107.7 pg/mL和23.9 pg/mL。重要的是，该方法与NfL和NfH无交叉反应，显示出高度的特异性。平行性实验表明最小 required稀释度(MRD)为1:2，但在后续测量中采用1:4稀释以确保更多样本落在校准曲线范围内。回收率分析显示重组蛋白的回收率达到96%，且人血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(IgG)的添加不影响检测结果，证明该方法抗干扰能力强。

Demographic features and neurofilament protein concentrations

研究队列的人口学特征显示各组间年龄无显著差异。相关性分析揭示，在对照组中，NfM浓度与年龄呈强相关（r=0.69-0.77，p<0.0001），但在患者队列中这种相关性消失。性别分析显示对照组中男性和女性的神经丝蛋白水平无显著差异。

NfM, NfL and NfH levels in the diagnostic groups

所有三种神经丝蛋白在ALS患者中均显著升高，与对照组和CTRL.DD组相比均有极显著差异(p<0.0001)。NfM和NfL在FTD和AD患者中也显著升高，而NfH在这些疾病中未显示显著差异。值得注意的是，NfH在区分ALS和FTD方面表现出最好的鉴别能力(p<0.0001)。在ALS亚组分析中，中等至快速进展者的NfM水平升高最为显著(p=0.0007)。在FTD亚型中，非流利型原发性进行性失语(nfvPPA)和语义型原发性进行性失语(svPPA)患者的NfM和NfL水平显著高于logopenic变异型原发性进行性失语(lvPPA)患者。

Associations of CSF neurofilaments with each other and ATN scores

在整个队列中，CSF NfM与CSF NfL表现出极强的相关性(r=0.93，95% CI: 0.91–0.94，p<0.0001)，与NfH的相关性较弱(r=0.68)。特别值得注意的是，在AD队列中，NfM与磷酸化tau181(pTau181)和总tau(tTau)蛋白显示出最强的相关性(r=0.71和0.77)，而NfL的相关性较弱，NfH则无显著相关性。这一发现提示NfM在AD病理过程中可能与tau蛋白病理有更密切的关联。

Discriminative potential of CSF neurofilament proteins

ROC分析显示所有三种神经丝蛋白都能有效区分ALS与对照组，NfM、NfL和NfH的AUC值分别为0.95、0.98和0.92。在区分ALS与CTRL.DD方面，三种蛋白也表现出优异的诊断性能(AUC: 0.96-0.99)。NfM和NfL在区分AD和FTD与对照组方面显示出高准确性(AUC: 0.89-0.92)。特别值得注意的是，NfH在区分ALS与FTD方面表现最佳(AUC: 0.96)。然而，神经丝蛋白组合使用并未提高诊断准确性。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次提供了NfM与NfL、NfH在神经退行性疾病中的定量比较，填补了该领域的重要空白。研究发现NfM在多种神经退行性疾病中均显著升高，其变化模式更接近NfL而非NfH，尽管在氨基酸序列和结构上NfM与NfH更为相似。这一发现提示不同神经丝蛋白亚型在疾病过程中可能具有不同的释放动力学和病理生理意义。

特别值得注意的是，NfM在AD患者中与tau生物标志物(pTau181和tTau)表现出最强的相关性，这为理解AD的病理机制提供了新的视角。研究人员推测，这种强相关性可能反映了NfM在AD特有的神经元损伤机制中的特殊作用，值得进一步深入研究。

在诊断应用方面，虽然NfM显示出与NfL相似的诊断性能，但NfH在区分ALS与FTD方面的卓越表现(AUC: 0.96)表明不同神经丝蛋白亚型在不同疾病背景下可能具有互补的诊断价值。这种差异可能源于不同神经元类型中神经丝蛋白的组成差异：ALS主要影响富含NfH的大型运动神经元，而FTD主要影响皮质神经元，其NfH含量较低。

该研究的临床意义在于为神经退行性疾病的诊断和鉴别诊断提供了新的生物标志物选择。特别是对于ALS的早期诊断和与FTD的鉴别诊断，NfH显示出独特价值。此外，NfM与tau蛋白的强关联性为AD的研究提供了新的方向。

研究人员也指出了研究的局限性，包括横断面设计无法追踪NfM随时间的变化，以及某些亚组样本量较小。他们建议未来研究应扩大样本规模，特别是针对FTD和AD患者，开展纵向研究以评估NfM的动态变化，并探索NfM在神经炎症性疾病中的作用。同时，研究不同脑区中神经丝蛋白的表达和分布差异将有助于阐明它们在各种神经系统疾病中的特定作用机制。

这项研究不仅提供了一种可靠的NfM检测方法，更重要的是为理解神经丝蛋白在神经退行性疾病中的生物学意义提供了新的见解，为未来开发基于多生物标志物panel的诊断策略奠定了坚实基础。