1型糖尿病候选基因PTPN2与BACH2调控人β细胞中IFN-α诱导的JAK/STAT与MAPKs通路交互作用新机制

本研究聚焦1型糖尿病（T1D）中β细胞自身免疫破坏的关键机制，探讨了候选基因PTPN2和BACH2如何通过调控STAT1酪氨酸（Y701）和丝氨酸（S727）位点的磷酸化，介导JAK/STAT与MAPKs通路的交互作用，从而影响干扰素-α（IFN-α）信号传导。研究发现这两个磷酸化位点分别调控CXCL10和MHC I类分子的表达，且其动态激活模式具有时间依赖性。该研究为开发针对特定基因多态性的T1D治疗策略提供了重要理论依据。

　　

在1型糖尿病（T1D）复杂的发病机制中，胰腺β细胞的自身免疫性破坏是核心环节。干扰素（IFNs）等细胞因子在这一过程中扮演了关键角色，尤其是I型干扰素IFN-α，它不仅在病毒防御中起作用，更被发现在T1D患者的胰岛中有表达，并在疾病早期就呈现出特征性的“干扰素签名”。然而，IFN-α是如何精确调控β细胞内的信号传导，从而导免疫识别和细胞损伤的，其详细分子机制仍不十分清晰。

更值得关注的是，全基因组关联研究（GWAS）已鉴定出超过80个与T1D风险相关的基因位点，其中约80%的候选基因在β细胞中表达，提示β细胞自身主动参与了疾病的触发与进展。在众多候选基因中，蛋白酪氨酸磷酸酶非受体2型（PTPN2）和碱性亮氨酸拉链转录因子2（BACH2）格外引人注目。它们不仅与T1D易感性相关，也与其他自身免疫病如类风湿关节炎、克罗恩病有关。PTPN2已知能负向调控JAK/STAT通路，而BACH2则被报道可调节PTPN2的表达，但二者如何协同作用，精细调控IFN-α信号，特别是其对信号转导与转录激活因子1（STAT1）不同位点磷酸化的影响，仍是一个待解的谜题。STAT1的完全活化需要其酪氨酸701位点（Y701）和丝氨酸727位点（S727）的磷酸化，前者与快速、短暂的JAK/STAT通路激活相关，后者则可能与信号的长期维持有关。阐明这两个关键候选基因如何通过调控STAT1的动态磷酸化过程影响β细胞命运，对于理解T1D病理过程和开发靶向治疗策略具有至关重要的意义。

为此，由Arturo Roca-Rivada和Decio L. Eizirik共同领导的研究团队在《eBioMedicine》上发表了一项研究，他们利用多个人类β细胞模型，深入探究了PTPN2和BACH2在IFN-α信号传导中的作用，揭示了其通过调控STAT1不同磷酸化位点介导JAK/STAT与MAPKs通路交互对话的新机制。

本研究综合利用了多种关键技术方法：1. 基因沉默技术（RNA interference）：在人β细胞系（EndoC-βH1）、iPSC来源的类胰岛细胞及HeLa细胞中使用siRNA特异性敲低PTPN2、BACH2、JNK1、p38 MAPK等基因表达。2. 分子生物学技术：包括蛋白质免疫印迹（Immunoblot）检测蛋白表达与磷酸化水平，实时定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子分泌。3. 细胞功能分析：通过免疫荧光显微镜和核质分离技术观察STAT1的亚细胞定位，采用流式细胞术（Flow cytometry）检测HLA-ABC细胞表面表达，并通过Hoechst 33342和碘化丙啶染色评估细胞死亡。4. 质粒转染与突变体分析：在STAT1基因敲除的HeLa细胞中转染STAT1 S727A或Y701F突变体质粒，以研究不同磷酸化位点的功能。5. 生物信息学分析：利用TFTF R软件包预测BACH2的靶基因并进行功能富集分析。研究所用的人胰岛来自非糖尿病器官捐献者（比利时布鲁塞尔ULB和法国里尔CHU的隔离中心）。

BACH2调控细胞因子诱导的PTPN2表达

研究人员首先在EndoC-βH1细胞和iPSC来源的类胰岛细胞中验证了BACH2对PTPN2的调控作用。发现沉默BACH2后，无论是IFN-α还是TNF-α刺激，PTPN2的蛋白表达水平均显著降低。这证实了BACH2是PTPN2表达的一个上游调节因子。

BACH2和PTPN2调控STAT1总活性

接下来，研究聚焦于STAT1的激活。发现沉默PTPN2或BACH2都会增强IFN-α诱导的STAT1-Y701磷酸化（p-STAT1-Y701），但这种增强效应是短暂性的，在刺激4小时后最明显，24小时后则减弱或消失。与此相反，STAT1-S727磷酸化（p-STAT1-S727）则呈现缓慢增加的趋势，在24小时达到峰值，并且在沉默PTPN2或BACH2后，其磷酸化水平显著增强。这表明PTPN2和BACH2共同负向调控STAT1的两个关键磷酸化位点。

STAT1在β细胞核内的定位受PTPN2调控且具有位点和时间依赖性

通过免疫荧光和细胞核质分离实验，研究人员细致地描绘了STAT1的动态分布图景。在IFN-α刺激1小时后，p-STAT1-Y701主要位于细胞核内；而到24小时后，核内p-STAT1-Y701信号大幅减弱，剩余的分布于胞质中。与之形成鲜明对比的是，p-STAT1-S727在刺激24小时后才清晰地富集于细胞核内。当PTPN2被沉默后，两种磷酸化形式的STAT1在胞质和胞核中的水平均升高。这清晰地表明，STAT1的磷酸化、核转位和功能发挥是一个高度动态且受到精密调控的过程，而PTPN2是这一过程的关键“刹车”。

PTPN2和BACH2调控CXCL10的长期表达和分泌以及HLA I类蛋白的表达

那么，这种动态的STAT1磷酸化对下游基因表达有何功能性的影响呢？研究发现，沉默PTPN2或BACH2会显著增强IFN-α长期（48小时）刺激引起的CXCL10（一种重要的趋化因子）的mRNA表达、蛋白合成和分泌。对于主要组织相容性复合物（MHC）I类分子（HLA-A和HLA-E），沉默PTPN2同样增强了它们的表达；而沉默BACH2的影响则较为复杂，虽然它增加了细胞表面HLA-ABC的蛋白表达水平，却减少了表达HLA-ABC的阳性细胞比例。这表明这两个基因通过调节β细胞的“免疫警报”状态（表达趋化因子招募免疫细胞）和“抗原呈递”能力（表达MHC分子被T细胞识别），共同调控了β细胞与免疫系统的对话。

STAT1-Y701和STAT1-S727对于启动IFN-α转录程序至关重要

为了直接论证两个磷酸化位点的功能，研究巧妙地利用了STAT1基因敲除的HeLa细胞模型，并分别转染了只能被磷酸化在一个位点的STAT1突变体（Y701F或S727A）。令人惊讶的发现是，CXCL10的表达可以被任一单个磷酸化位点的激活所诱导；然而，MHC I类分子（HLA-A和HLA-E）的表达则严格依赖于两个位点同时被磷酸化。这揭示了STAT1下游基因调控的精密分层：某些基因（如CXCL10）的门槛较低，而另一些基因（如MHC I）则需要STAT1的完全活化。

STAT1-Y701和STAT1-S727磷酸化可被解离，表明人β细胞中JAK/STAT和MAPKs通路存在交互对话

研究人员进一步通过药理学方法解耦了这两个通路。使用JAK1/2抑制剂（Baricitinib）或TYK2抑制剂（BMS-986165）可以有效抑制STAT1-Y701的磷酸化，但对STAT1-S727的磷酸化和STAT1的总蛋白表达影响甚微。相反，通过siRNA沉默或化学抑制剂（SP600125）阻断MAPKs通路中的JNK1时，则特异性抑制了STAT1-S727的磷酸化，而不影响Y701位点。这强有力地证明，IFN-α通过JAK/STAT通路主要驱动STAT1-Y701的快速磷酸化，而MAPKs通路（特别是JNK1）则负责其S727位点的磷酸化，两条通路既独立又协同。

p38 MAPK是STAT1激活的关键参与者，其磷酸化受PTPN2和BACH2调控

深入研究MAPKs通路，研究人员发现另一个关键成员p38 MAPK也参与其中。沉默PTPN2或BACH2会导致IFN-α诱导的p38 MAPK磷酸化水平升高。更重要的是，直接沉默p38 MAPK本身，不仅能抑制STAT1-S727的磷酸化和总STAT1的表达，还能部分保护β细胞免受IFN-α诱导的细胞死亡，并减少CXCL10的产生。这表明p38 MAPK是PTPN2/BACH2调控轴下游的一个关键效应分子，直接参与了STAT1-S727的磷酸化和后续的病理效应。

JAK/STAT和MAPKs通路的调控对于控制原代人胰岛中的IFN-α反应也至关重要

最后，研究在原代人胰岛中验证了上述发现。使用Baricitinib、TYK2抑制剂或JNK抑制剂均能有效抑制IFN-α引起的CXCL10分泌和STAT1的表达。JAK/STAT抑制剂对MHC I类分子表达的抑制效果最强，而JNK抑制剂的效果相对温和但显著。这证实了在生理相关的原代细胞中，JAK/STAT和MAPKs通路同样是调控IFN-α反应的核心机制。

本研究通过一系列严谨的实验，揭示了1型糖尿病候选基因PTPN2和BACH2在人类β细胞中调控IFN-α信号的一个精妙模型。BACH2作为上游调节因子，控制着PTPN2的表达。PTPN2则扮演着核心的负向调控角色，一方面直接去磷酸化STAT1的Y701位点（JAK/STAT通路），另一方面通过抑制JNK1和p38 MAPK的活性，间接抑制STAT1的S727位点磷酸化（MAPKs通路）。这两个磷酸化事件呈现出截然不同的动力学特征：Y701磷酸化快速而短暂，主要负责信号的启动；S727磷酸化缓慢而持久，与IFN-α的长期效应相关。它们共同决定了STAT1的转录活性，从而精密调控了下游诸如CXCL10和MHC I类分子等关键免疫相关基因的表达。

该研究的发现具有多重重要意义。首先，它极大地深化了对1型糖尿病β细胞自身免疫机制的理解，将遗传易感基因（PTPN2, BACH2）、细胞内信号通路（JAK/STAT, MAPKs）和最终的病理表型（ chemokine分泌、抗原呈递、细胞死亡）有机地串联起来。其次，研究揭示了STAT1激活的动态性和复杂性，其不同磷酸化位点可能承担着不同的生物学功能，这为开发更精准的靶向治疗策略提供了新的思路。例如，针对特定的磷酸化位点或特定的下游输出（如选择性抑制CXCL10而非MHC I）可能带来更好的疗效和更少副作用。再者，鉴于PTPN2和BACH2在其他自身免疫病中的广泛作用，以及JAK/STAT和MAPKs通路的核心地位，本研究的结果很可能也适用于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等其他疾病领域，具有广泛的借鉴价值。最后，研究提示联合靶向JAK/STAT和MAPKs通路或许能更有效地抑制异常的IFN-α信号，这为未来开发新的联合疗法指明了方向。