臭氧暴露通过加速衰老介导糖尿病视网膜微血管重塑：一项大规模回顾性队列研究

本研究针对长期臭氧(O3)暴露对糖尿病视网膜微血管系统的影响机制尚不明确的问题，通过纳入55,463名2型糖尿病患者，结合高分辨率臭氧暴露评估和深度学习视网膜影像分析技术，首次发现O3暴露与视网膜加速衰老（RAG增加2.29年/10μg/m3）及微血管重塑（CRAE、CRVE、Df降低，VT减少）显著相关。中介分析揭示衰老加速是重要介导通路。该研究为臭氧致心脑血管风险提供了新型生物标志物证据，对环境污染疾病防控具有重要临床意义。

　　

随着全球大气污染加剧，地面臭氧(O₃)作为关键二次污染物，其浓度在2010-2021年间呈现显著上升趋势。据全球疾病负担估计，2021年臭氧暴露导致全球约49万例过早死亡和870万残疾调整生命年损失。尤其随着人口老龄化加速，臭氧相关的疾病负担预计将日益严重。尽管流行病学证据将臭氧暴露与心脑血管疾病发病率相关联，但其对微血管系统的具体影响仍缺乏表征，且臭氧与心脑血管疾病之间的因果关系尚未明确。

视网膜微血管改变已成为全身内皮功能障碍的敏感生物标志物和心脑血管事件的预测因子。视网膜血管摄影作为一种无创活体成像 modality（方式），可有效评估人类微血管特征，因为视网膜血管直径介于60-300μm之间。多项研究表明，小动脉狭窄、小静脉扩张、血管曲折度降低和分形维度减小与心肌梗死、中风和心血管死亡风险增加独立相关。近年来新兴证据表明，基于视网膜图像的人工智能(AI)模型可计算视网膜年龄，视网膜年龄与chronological age（时序年龄）之间的差异可作为加速衰老的有意义指标。这种新型生物标志物已显示出对多种病理的预测价值，包括全因死亡率、心脑血管疾病、帕金森病、糖尿病视网膜病变(DR)和糖尿病肾病。

在此背景下，研究人员针对糖尿病群体——一个具有固有微循环功能障碍且易发生多系统并发症的人群——开展了一项大规模研究，旨在系统评估长期臭氧暴露对视网膜年龄差距和微血管特征（血管口径、曲率、分形维度）的影响。研究假设升高的臭氧暴露可能与糖尿病群体的视网膜血管形态改变相关，反映臭氧诱导的血管内皮功能障碍可能通过加速衰老途径介导。

该研究发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》，基于上海糖尿病眼病队列研究(SCODE)，纳入2017年来自上海17个行政区249个社区的55,463名2型糖尿病患者。暴露评估利用卫星衍生的1 * 1 km空间分辨率臭氧浓度估算值，汇总五年(2013–2017)臭氧暴露指标。视网膜血管表型分析包括中央视网膜动脉等效(CRAE)、中央视网膜静脉等效(CRVE)、动静脉比(AVR)、血管曲折度(VT)和分形维度(D_f)。采用视网膜年龄差距(RAG)反映加速衰老，定义为深度学习预测的视网膜年龄与chronological age之间的差异。统计分析采用双机器学习(DML)进行多变量回归分析，并进行了中介效应分析。

2.1. 研究设计与参与者

研究基于SCODE，旨在调查上海社区登记人群中2型糖尿病患者眼部并发症的发病率和风险因素。SCODE自2016年起每年对所有社区(n=249)的登记糖尿病患者进行综合眼部和全身检查。最终分析纳入55,463名个体(75.5%)。

2.2. 数据收集

调查包括：通过问卷收集基本人口统计信息；基本测量如身高、体重和血压；眼部检查包括未矫正和presenting visual acuity（presenting视力）、裂隙灯检查以及使用非散瞳视网膜相机进行眼底摄影；空腹血糖测试。

2.3. 视网膜血管参数测量

使用右眼视盘中心图像作为主要分析数据集。整合计算机视觉和深度学习来自动测量视网膜照片中的血管直径和曲折度。处理后的图像输入深度学习网络ResNet101-UNet进行血管分割，根据颜色、亮度和血管系统内的拓扑关系区分视网膜小动脉和小静脉。随后应用形态学侵蚀获得血管中心线。计算六个最大直径的小动脉和小静脉的CRAE和CRVE。量化血管曲折度(VT)通过计算每条血管中心线上的平均曲率。分形维度(D_f)主要计算为血管结构的盒计数维度。

2.4. 视网膜年龄差距测量

先前开发了基于彩色眼底图像的深度学习(DL)模型用于年龄预测。RAG定义为DL模型预测的视网膜年龄与实际年龄之间的差异。

2.5. 暴露分配

臭氧浓度基于高分辨率暴露评估模型进行估算，预测地面最大每日8小时平均(MDA8) O₃浓度。PM_2.5浓度使用基于卫星的暴露评估模型进行预测。

2.6. 统计分析

采用双机器学习(DML)研究O₃对RAG以及视网膜血管参数的影响。控制了年龄、性别、血压、BMI、空腹血糖水平、DM病程、筛查季节、饮酒、吸烟状况和体育锻炼时间等协变量。

3. 结果

研究人群平均年龄64.8岁，55.2%为女性。平均DM病程8.0年，平均BMI 24.5 kg/m2。平均RAG为-0.2±4.6年。平均CRAE和CRVE分别为136.9±16.9 μm和228.0±27.8 μm。平均视网膜血管曲折度(×10⁴)为10.1±1.5，分形维度(×10³)为1484.8±44.9。五年平均O₃暴露为41.6±1.3 μg/m3。

多变量回归分析显示，O₃每增加10 μg/m3，CRAE减少4.03 μm，CRVE减少8.35 μm，VT(×10⁴)减少0.38，D_f(×10³)减少13.7，RAG增加2.29年。中介分析显示，加速衰老是臭氧暴露与CRAE、CRVE和D_f减少之间的中介通路。

亚组分析显示，长期臭氧暴露在所有亚组中一致地增加RAG，并降低CRVE、血管曲折度和分形维度。关于CRAE，高血压状态修改了这种关系，高血压组中CRAE显著减少，但非高血压参与者中无关联。季节变化也很明显，臭氧在夏秋季显著降低CRAE，但在春冬季则不显著。

敏感性分析显示，进一步调整PM_2.5和使用替代机器学习方法对结果影响最小。累积臭氧暴露窗口（1年与3年平均）的效应估计在大多数结果中表现出时间稳定性。

4. 讨论与结论

研究表明，在糖尿病人群中，长期暴露于较高臭氧浓度与加速视网膜衰老、更窄的CRAE和CRVE以及降低的血管曲折度和分形维度相关。臭氧可能通过抑制eNOS活性和减少NO诱导视网膜微血管收缩和血管直径减小。慢性臭氧暴露可能进一步损害内皮功能，导致血管更僵硬（曲折度降低）和血管网络更稀疏（分形维度降低）。

研究发现长期臭氧暴露与视网膜年龄差距增加相关，表明加速视网膜衰老。臭氧诱导的视网膜血管表型改变轨迹与衰老相关的改变平行。视网膜年龄不仅指示局部视网膜衰老，还是全身衰老的生物标志物，包括心血管、脑血管和神经衰老。

研究首次发现，环境臭氧浓度每增加10 μg/m3，视网膜年龄差距(RAG)平均增加2.29年。基于剂量反应关系，观察到的2.29年RAG增加可能对应约：全因死亡风险增加4%，心血管疾病风险增加6%，中风风险增加8%，终末期肾病风险增加20%。这些估计与先前关于臭氧暴露增加糖尿病相关死亡风险的报告一致。

总体而言，亚组和敏感性分析结果保持稳健。对于CRAE，臭氧的效应仅在夏秋季显著，而在春冬季则不显著。这些发现与夏季和高温相关的臭氧暴露和死亡风险增加一致。此外，高血压患者对臭氧对CRAE的影响表现出增加的易感性。

该研究采用AI衍生的视网膜年龄估计和血管参数量化，结合多中心大数据，使用双机器学习方法系统研究臭氧对视网膜微循环的影响。研究结果表明，臭氧暴露与微循环系统中的加速衰老和内皮功能障碍相关，这两者已被确定为心脑血管发病率和死亡率增加的风险因素。显著的是，这项研究不仅为臭氧对人类微循环和衰老的影响提供了新颖证据，而且提出了一个连接大气臭氧污染与心血管发病机制的合理解释框架。

研究的局限性包括仅纳入糖尿病人群影响普适性、单区域采样、回顾性队列设计以及暴露评估的局限性。未来研究应实施全国性前瞻性队列研究以建立因果推断，同时纳入更广泛的人口谱以增强内部有效性和普适性。

综上所述，研究结果表明长期臭氧暴露与加速视网膜衰老、减少小动脉和小静脉口径、降低血管曲折度和分形维度相关。臭氧相关的血管内皮功能障碍可能通过加速衰老介导。这些结果表明视网膜年龄和微血管参数可作为臭氧暴露的生物标志物，用于识别心血管高风险人群。此外，臭氧的微血管效应在夏季和秋季更为明显。此外，患有高血压合并症的糖尿病患者需要警惕臭氧的微循环影响。这突出了优先采取臭氧相关健康风险缓解策略的关键时期和脆弱人群。