天然化合物库筛选发现雷公藤甲素通过抑制内质网应激缓解冈田酸诱导的肠屏障功能障碍

本研究针对腹泻性贝类毒素冈田酸(OA)诱导的肠道功能障碍缺乏特异性治疗药物的问题，通过高通量筛选2131种天然化合物，发现雷公藤甲素(triptolide)能显著抑制OA诱导的内皮细胞凋亡。体内实验证实triptolide可降低肠道通透性，改善黏膜损伤；机制研究揭示其通过调控eIF2α磷酸化水平抑制内质网应激(ER stress)，为OA中毒提供了新型治疗策略。

　　

海洋中的腹泻性贝类毒素一直威胁着人类健康，其中冈田酸(Okadaic acid, OA)作为一种常见的海洋毒素，可通过食用受污染的贝类进入人体，引起腹泻、恶心、呕吐等肠道症状，严重时甚至导致肠上皮完整性破坏和肿瘤形成。尽管OA的毒性机制已有较多研究，但长期以来缺乏特异性治疗药物，使得开发高效低毒的抗OA中毒药物成为迫切需求。

在这项发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》的研究中，第二军医大学海军医学系卫生毒理学教研室的张继千珠等研究人员通过系统性研究，发现传统中药雷公藤中的活性成分雷公藤甲素(triptolide)能够有效缓解OA诱导的肠道功能障碍，并深入揭示了其作用机制。

研究人员采用了一系列关键技术方法开展本研究。首先通过高通量化合物筛选技术对2131种天然化合物进行三轮筛选；利用CCK-8法检测细胞活力；通过体内实验使用FITC-葡聚糖检测肠道通透性；采用组织病理学检查和透射电镜观察肠道形态学变化；运用RNA测序(RNA-seq)技术进行转录组分析；通过Western blotting检测蛋白表达；使用qRT-PCR验证基因表达水平。实验使用了ICR小鼠模型和HUVEC细胞模型。

2.1. 通过化合物库筛选鉴定雷公藤甲素作为OA诱导内皮细胞死亡的抑制剂

研究人员通过CCK-8检测发现OA对HUVEC的24小时半抑制浓度(IC₅₀)为0.6029 μM。经过三轮筛选，从2131种天然化合物中鉴定出triptolide具有最佳保护效果，其IC₅₀值为0.16 μmol/L。

2.2. 雷公藤甲素缓解OA诱导的肠屏障破坏

体内实验显示，OA以剂量依赖方式增加血浆FITC-葡聚糖浓度，而triptolide处理显著降低了这一指标。组织学检查发现triptolide治疗组小鼠结肠黏膜上皮侵蚀、隐窝损伤和炎症细胞浸润较少。透射电镜显示triptolide减轻了OA引起的肠屏障轻度水肿和上皮细胞损伤。

2.3. 雷公藤甲素抑制OA诱导的内皮细胞凋亡

通过pSIVA染色检测早期凋亡事件，发现OA处理增加了pSIVA阳性细胞数量，而triptolide以剂量依赖方式保护细胞免受OA诱导的凋亡。Western blotting分析显示，OA处理显著增加了cleaved caspase 3和cleaved PARP的表达，而triptolide处理显著降低了这些凋亡标志蛋白的表达水平。

2.4. 雷公藤甲素的保护作用不依赖于ERCC或其激活蛋白磷酸酶

通过生物素标记triptolide的羟基位点，发现该位点对其抑制OA诱导凋亡的功能至关重要。研究发现triptolide的保护作用不依赖于ERCC抑制或蛋白磷酸酶的激活，甚至增强了OA对重组PP5c蛋白的抑制活性。

2.5. 内质网应激通路是雷公藤甲素缓解OA诱导细胞凋亡的关键通路

RNA-seq分析显示，OA组与OA+Tri组之间存在4842个差异表达基因。KEGG通路富集分析发现这些基因主要参与内质网中的蛋白质加工、凋亡等过程。triptolide显著抑制了OA引起的凋亡和内质网蛋白质加工过程。

2.6. mRNA水平上qRT-PCR验证内质网应激通路基因

qRT-PCR验证发现，与OA组相比，OA+Tri组中Atf4、Atf6、Bip、Chop、Eif和Xbp1的转录水平显著下调，表明triptolide减弱了OA处理细胞内质网应激相关基因的转录激活。

2.7. 雷公藤甲素对OA损伤的HUVEC中各种内质网应激通路蛋白表达水平的影响

Western blotting结果显示，与OA组相比，OA+triptolide组细胞p-eIF-2α表达显著增加，p-eIF-2α/eIF-2α比值显著升高，ATF4蛋白表达显著降低，表明triptolide通过抑制OA引起的内质网应激过程来阻断凋亡。

研究结论与讨论部分指出，triptolide通过减少OA作用下细胞内eIF2α的磷酸化来抑制未折叠蛋白反应(UPR)，减轻内质网应激过程，抑制caspase-3和PARP的激活，保护细胞免受OA诱导的内皮细胞凋亡。同时，triptolide降低了小鼠肠道通透性，保护肠道组织和结构免受损伤。这些发现表明triptolide可开发为潜在的OA解毒剂，为治疗OA相关中毒提供了新的治疗策略。

该研究的创新性在于首次发现triptolide对OA诱导的肠道功能障碍具有保护作用，并深入揭示了其通过调控内质网应激通路发挥作用的分子机制。这不仅为OA中毒提供了潜在的治疗药物，也为理解OA的毒性机制提供了新的视角，具有重要的理论意义和临床应用价值。