聚苯乙烯纳米塑料通过干扰肺代谢（嘌呤与花生四烯酸代谢）诱发小鼠肺损伤的机制研究

本刊推荐：为阐明空气中纳米塑料(PSNPs)的呼吸健康风险，研究者开展PSNPs（含氨基修饰PSNP-NH2）的肺毒性机制研究。通过体内外实验证实PSNPs干扰肺代谢谱（尤其嘌呤与花生四烯酸代谢），诱发氧化应激（CAT/GSH-Px/MDA失衡）与炎症（IL6/IL1B/TNFA↑），且表面氨基修饰加剧毒性。该研究为评估空气纳米颗粒物健康效应提供代谢视角新证据。

　　

随着塑料制品的大规模生产与低回收率，环境中塑料污染日益严重。大块塑料废弃物经过长期物理、化学及生物作用，可分解为尺寸小于5毫米的微塑料（microplastics）和小于100纳米的纳米塑料（nanoplastics）。近年来，研究不仅在大气中检测到微纳米塑料的存在，更在人体肺组织尸检样本、手术切除的肺组织标本以及呼吸系统疾病患者的支气管肺泡灌洗液中发现了它们的踪迹。这些发现引发了人们对微纳米塑料可能对人类呼吸系统健康造成潜在危害的日益关注。尽管已有一些体外研究表明微纳米塑料能在肺上皮细胞模型中诱导细胞死亡、形态改变和细胞器损伤，少数体内研究也揭示其会导致动物肺部炎症和结构紊乱，但相对于水体和土壤生态系统，空气中对塑料颗粒的肺毒性评估研究仍较为缺乏，其具体作用机制尚不明确。

代谢组学（metabolomics）作为一种新兴的组学技术，能够全面揭示生物体在疾病或污染物暴露下细胞内或组织内源性代谢物的变化，其整体代谢改变与生物体的特定生理状态直接相关。近年来，代谢组学方法已被用于阐明包括微纳米塑料在内的各种环境污染物的毒性内在机制。研究表明，代谢紊乱可能是微纳米塑料对细胞和组织产生毒性的重要生物学机制。肺是一个代谢活跃的器官，拥有许多公认的代谢酶。最近的研究表明，纳米塑料可通过影响肺上皮细胞系中的三羧酸循环、谷胱甘肽和嘌呤代谢等导致线粒体损伤。然而，关于吸入微纳米塑料对肺组织代谢途径影响的研究非常缺乏，迫切需探索肺代谢谱及其在塑料颗粒介导的肺损伤中的作用。

塑料颗粒的尺寸和表面修饰是影响其毒性的两个重要因素。纳米塑料因其更小的尺寸，相较于微塑料，对特定生物体表现出更强的毒性。同时，表面修饰，如氨基化，也可能使塑料颗粒比未修饰或羧基化修饰的颗粒诱发更严重的组织损伤。聚苯乙烯（Polystyrene, PS）是一种产量高、用途广泛的塑料类型，常用于橡胶轮胎和合成纺织品等产品。据报道，在人类血液样本的塑料颗粒聚合物成分中，PS贡献了36%的比例。作为空气中主要的微纳米塑料之一，PS颗粒已在人类肺样本中被检测到。因此，本研究选择聚苯乙烯纳米塑料（PSNPs）作为实验模型，通过体内外实验评估纳米塑料经吸入暴露后的肺毒性，并探讨其潜在机制。相关研究成果发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上。

为开展本研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。动物实验使用BALB/c小鼠，通过气管滴注法（intratracheal instillation）进行PSNPs暴露，剂量参考了现实世界中人类纳米塑料吸入水平的估算值。通过透射电子显微镜（TEM）观察了PSNPs在肺组织中的积累情况，并采用苏木精-伊红（H&E）染色进行组织病理学检查。氧化应激水平通过检测 catalase (CAT)、glutathione peroxidase (GSH-Px) 活性、malondialdehyde (MDA) 含量和总抗氧化能力（T-AOC）等生物标志物进行评估。炎症反应则通过免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）染色检测炎症因子（IL6, IL1B, TNFA）和免疫细胞（巨噬细胞F4/80、中性粒细胞LY6G）浸润，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清中炎症因子浓度。核心的机制探索采用了非靶向代谢组学（non-targeted metabolomics）技术对肺组织样本进行分析，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术鉴定差异代谢物，并利用KEGG数据库进行通路富集分析。体外实验采用人肺上皮BEAS-2B细胞系，通过MTT法检测细胞活力，利用荧光显微镜和流式细胞术（flow cytometry）评估PSNPs的细胞摄取，并检测了细胞内活性氧（ROS）水平、乳酸脱氢酶（LDH）释放以及关键代谢酶（XOD, ATP）和基因（PLA2, COX2）的表达变化。

3.1. PSNPs的表征

研究人员首先对使用的PSNPs进行了表征。扫描电子显微镜（SEM）分析显示，无论是未修饰的PSNP-B还是氨基修饰的PSNP-NH₂均呈现球形且尺寸均匀。动态光散射分析表明，PSNP-B和PSNP-NH₂的平均流体动力学尺寸分别为182 nm和179 nm。此外，PSNP-B的Zeta电位值为-35.6 mV，而PSNP-NH₂为-16.5 mV，表明表面修饰导致了表面电荷的显著变化。

3.2. PSNPs暴露引起小鼠肺部组织病理学改变

通过气管滴注给小鼠暴露PSNP-B或PSNP-NH₂9天后，TEM分析证实了PSNP颗粒在肺组织细胞中的沉积，且PSNP-NH₂组的摄取似乎高于PSNP-B组。H&E染色显示，与对照组相比，PSNPs组，尤其是PSNP-NH₂组，小鼠支气管和肺泡壁增厚，表明在环境相关水平下PSNPs暴露可诱导明显的肺部病理变化。

3.3. PSNPs以表面修饰依赖性方式诱导肺组织抗氧化失衡和炎症

氧化应激生物标志物检测显示，PSNPs暴露引起了小鼠肺抗氧化系统的不同程度改变。PSNP-NH₂组相比对照组，CAT活性显著升高，而GSH-Px活性和MDA含量明显降低，抗氧化基因Nrf2和Ho1表达显著下调，总抗氧化能力（T-AOC）水平显著降低。PSNP-B组的变化则相对轻微。这表明PSNP-NH₂比PSNP-B在肺中诱发了更明显的氧化损伤。炎症方面，两种PSNPs均显著增加了肺组织中促炎因子IL6、IL1B和TNFA的基因和蛋白表达水平，并促进了巨噬细胞和中性粒细胞在肺组织的募集。血清中IL6和TNFA水平也升高，表明引发了系统性炎症。PSNP-NH₂组这些炎症指标的升高趋势更明显。

3.4. PSNPs以表面修饰依赖性模式改变肺组织代谢谱

代谢组学分析揭示了PSNPs对肺代谢的深远影响。与对照组相比，PSNP-B组鉴定出17个显著差异代谢物（SDMs，3个上调和14个下调），而PSNP-NH₂组则发现了293个SDMs（10个上调和283个下调），表明PSNP-NH₂对肺代谢产生了更多样和剧烈的影响。KEGG通路富集分析显示，PSNP-B组有6条通路显著富集，包括花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）等；而PSNP-NH₂组有19条通路显著富集，其中最显著的是嘌呤代谢（purine metabolism）和花生四烯酸代谢。花生四烯酸代谢是两者共同扰动的通路，但PSNP-NH₂组涉及更多代谢物。嘌呤代谢是PSNP-NH₂特异性扰动的通路。

3.5. 肺组织中嘌呤和花生四烯酸代谢的紊乱与PSNP暴露诱导的抗氧化失衡和炎症相关

对特定代谢通路的深入分析发现，在嘌呤代谢通路中，PSNP-NH₂暴露导致多种嘌呤代谢物水平降低，关键酶 xanthine oxidase (XOD) 的活性受到显著抑制。在花生四烯酸代谢通路中，PSNP-NH₂组所有检测到的16种代谢物均呈现下调，而PSNP-B组仅有3种代谢物失调。基因表达分析显示，PSNP-NH₂显著降低了磷脂酶A2 (Pla2) 的表达，而对环氧合酶2 (Cox2) 表达无显著影响；PSNP-B则显著降低了Cox2的表达，对Pla2无显著影响。Spearman相关分析进一步表明，这些显著差异代谢物的水平变化与氧化和炎症标志物显著相关，提示代谢紊乱与PSNPs暴露后的抗氧化系统失衡和炎症密切相关。

3.6. PSNPs对人肺上皮细胞氧化应激、炎症反应和代谢酶水平的影响

体外实验选用人肺上皮BEAS-2B细胞，验证PSNP-NH₂的毒性。细胞活力实验确定了后续实验的暴露浓度（31.25, 125, 250 μg/mL）。荧光显微镜和流式细胞术证实PSNP-NH₂能被BEAS-2B细胞摄取，且呈浓度和时间依赖性。PSNP-NH₂暴露24小时后，细胞内ROS生成增加，MDA含量升高，CAT和GSH-Px活性改变，抗氧化基因NRF2和HO1表达上调，促炎基因IL6、IL1B和TNFA表达显著上调。这些结果表明PSNP-NH₂进入人肺细胞后引发了氧化应激和炎症反应。在代谢方面，PSNP-NH₂处理降低了关键嘌呤代谢酶XOD的活性和重要代谢物ATP的水平，并下调了花生四烯酸代谢关键酶PLA2的基因表达，而对COX2表达无显著影响。LDH释放增加表明细胞膜完整性受损。使用内吞抑制剂细胞松弛素D（cytochalasin D）预处理后，PSNP-NH₂的细胞内化减少，同时其对XOD活性和PLA2表达的扰动效应被有效逆转，表明PSNPs的细胞摄取是其引发代谢紊乱的必要步骤。

本研究证实了PSNPs对小鼠肺和人肺上皮BEAS-2B细胞的毒性作用。结果表明，PSNPs诱导的氧化损伤和炎症可能是由代谢紊乱介导的。嘌呤代谢和花生四烯酸代谢是PSNPs干扰的主要代谢途径。重要的是，与PSNP-B相比，PSNP-NH₂引起了更明显的肺损伤以及更多样化的代谢改变。这些发现表明，肺代谢扰动是PSNP诱导肺损伤的一个可能机制。表面修饰通过改变颗粒的表面电荷，影响其与细胞膜的相互作用和细胞摄取，从而显著影响其毒性效应。研究所用的暴露剂量是基于人类每日微塑料吸入量的估算值转换而来，更真实地反映了城市空气中纳米塑料对呼吸健康的影响。

该研究的重要意义在于：首先，它将研究焦点对准了空气中纳米塑料这一未被充分评估的暴露途径，填补了相关领域的知识空白。其次，它首次系统地比较了表面修饰（氨基化）对纳米塑料肺毒性和代谢干扰效应的影响，证实表面性质是评估其健康风险的关键参数。第三，它创新性地运用代谢组学技术，揭示了肺代谢紊乱（特别是嘌呤和花生四烯酸代谢）是纳米塑料肺毒性的核心机制之一，将氧化应激、炎症与代谢调控网络联系起来，为理解其毒作用模式提供了新的视角和证据。最后，研究结合体内外实验，既在整体动物水平证实了效应，又在人源细胞模型上验证了关键发现，增强了研究结果外推至人的可靠性。这些发现为了解空气纳米颗粒物对人类呼吸健康的潜在影响提供了重要的科学依据，对未来风险评估和监管策略的制定具有指导意义。未来的研究可进一步探索不同尺寸、聚合物类型和长期暴露下纳米塑料的肺代谢效应及其与慢性呼吸系统疾病的关系。