混合发酵核桃粕高效制备高稳定性抗菌肽及其在番茄汁天然防腐中的应用研究

本研究通过混合益生菌发酵核桃粕，高效制备出具有广谱抑菌活性的抗菌肽（AMPs），其肽得率达64.18%，对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的最小抑菌浓度（MIC）仅为10 mg/mL。经纯化后的ODS2-8组分在极端pH、高温（121°C）、离子干扰（Na+、Ca2+）及蛋白酶环境中仍保持优异稳定性，并可通过破坏细胞膜结构（ATP/AKPase泄漏、膜电位/流动性改变、SEM形态观察）发挥抗菌作用，成功将番茄汁中微生物数量从8.57降至4.02 log10 CFU/mL，为植物副产物高值化利用与天然防腐剂开发提供创新策略。

　　

Highlight

通过混合益生菌发酵核桃粕高效制备抗菌肽（AMPs），肽得率高达64.18%，对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）表现出显著抗菌活性（最小抑菌浓度MIC = 10 mg/mL）。经超滤获得的3–10 kDa肽段保持相近MIC值。十八烷基硅烷（ODS）柱色谱进一步纯化得到ODS2-8组分，其MIC降至5 mg/mL。该组分在pH 3–11、高温（121°C）、离子干扰（Na⁺、Ca²⁺）及蛋白酶处理下均表现卓越稳定性。应用于番茄汁防腐时，ODS2-8使微生物数量从8.57降至4.02 log₁₀ CFU/mL。通过腺苷三磷酸（ATP）与碱性磷酸酶（AKPase）泄漏、膜电位、流动性及扫描电镜（SEM）形态分析证实，ODS2-8通过破坏细胞膜完整性发挥抗菌作用。这些发现证明了利用核桃粕生产AMPs的可行性，为其高效利用提供了新途径。

Introduction

抗菌肽（AMPs）是一类具有广谱抗菌活性、能有效抑制细菌和真菌的小分子生物活性肽。由于其独特的作用机制和低毒性，AMPs在医学（Zhang et al., 2021）、食品保鲜（Singh et al., 2024）和农业生物防治（Liu et al., 2021）等领域具有广阔应用前景。目前已有多种天然AMPs被鉴定，如尼辛（nisin）（de Arauz et al., 2009）和ε-聚赖氨酸（ε-PL）（Li et al., 2022）。然而，传统AMPs的生产主要依赖化学或酶法合成，存在成本高、产量低和活性谱窄等问题。尼辛是目前最广泛使用的食品防腐剂，但其仅对革兰氏阳性菌有效，且在中性、碱性条件及高温下活性下降（Vishweshwaraiah et al., 2021）。因此，开发高效、广谱且高稳定性的AMPs生产技术具有重要理论和实践意义。

发酵法可通过微生物产生的蛋白酶将原料中的大分子蛋白质水解为小肽，显著降低生产成本、提高生物利用度和肽得率（Chai et al., 2019）。目前，乳酸菌（LAB）（Venegas-Ortega et al., 2019）、芽孢杆菌属（Bacillus spp.）（Liu et al., 2024）和酵母（Rocha-Arriaga & Cruz-Ramirez, 2022）是发酵过程中主要使用的微生物 starter 培养物。例如，利用乳酸 casei（L. casei）在37°C下发酵72小时肯富亚种子蛋白，所得肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌表现出强抗菌活性，发酵多肽混合物的MIC值为4 mg/mL（Arulrajah et al., 2022）。芽孢杆菌属，特别是枯草芽孢杆菌（B. subtilis），能在发酵食品中产生多种抗菌化合物（Puan et al., 2023）。利用枯草芽孢杆菌E20发酵豆粕（FSBM）产生的FSB-AMP（HTSKALLDMLKRLGK）对溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus, VA）和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus, VP）具有强抗菌活性，MIC为72.5 mmol/L（Cheng et al., 2017）。

植物蛋白富含AMPs。这些肽隐藏于母体蛋白中，以非活性形式存在，需通过释放才能发挥其生物活性潜力（Farid et al., 2024）。核桃（Juglans regia L.）榨油后的核桃粕仍富含蛋白质（含量40–45%），但常被废弃或用作肥料和饲料，忽略了其经济有效的利用价值。其中球蛋白含量达17.57%，是AMPs的主要来源（Liu, Guo, et al., 2024; Wang et al., 2023）。研究表明，利用植物乳杆菌B7和枯草芽孢杆菌可从核桃粕中获取具强抗真菌活性的AMPs（如YVVPW），对Pseudomonas victoria的MIC为16.0 mg/mL（Hu et al., 2024）。因此，利用微生物发酵核桃粕生产AMPs具有巨大研究潜力。

本研究以核桃粕为发酵底物，采用混合培养发酵技术，旨在实现核桃加工副产物的高值化并发掘具有高效抗菌活性的新型肽类。通过系统优化发酵参数，创新性地提出AMPs的生产策略。基于16S rRNA测序结果，评估了核桃AMPs（ODS2-8组分）在番茄汁中的保鲜效果，并初步探索了其抗菌机制。本工作为可持续植物废弃物的价值提升建立了创新策略，同时为环保型AMPs的生产及其商业化转化提供了基础见解。

Conclusion

本研究成功利用核桃粕通过混合菌发酵制备出抗菌肽发酵液。纯化后的抗菌肽发酵液对酸、碱、盐离子和蛋白酶具有优异稳定性，并对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出强抗菌活性。其作用机制归因于破坏细胞膜完整性，导致细胞内物质泄漏和细胞死亡。该研究为核桃粕的高效利用提供了新途径，并为开发天然食品防腐剂提供了理论依据。