汾香型白酒大茬与二茬酒醅微生物组与代谢组整合分析揭示乳酸菌群落演替驱动风味形成机制

本研究针对汾香型白酒两轮发酵（大茬Dacha与二茬Ercha）过程中风味形成机制不清的问题，采用宏基因组学与非靶向代谢组学技术，系统解析了酒醅微生物群落结构、功能基因及代谢物差异。研究发现两轮发酵筛选出不同的乳酸菌(LAB)群落，其中L. acetotolerans主导大茬而A. jinshanensis主导二茬；鉴定出225种差异代谢物，包括大茬中富集的黄酮类化合物和二茬中突出的嘧啶代谢途径；关键LAB物种与风味物质形成显著相关。该研究为通过标记物种/基因的阶段靶向监测和理性发酵剂设计来调控白酒风味提供了科学依据，对提升传统发酵食品品质具有重要指导意义。

　　

在中国传统白酒酿造体系中，汾香型白酒作为三大基础香型之一，以其独特的"清蒸二次清、地缸发酵"工艺著称。其生产过程包含大茬（Dacha）和二茬（Ercha）两轮发酵，分别产出具有不同风味特征的基础酒：大茬酒醅发酵产物香气浓郁、入口醇甜，二茬酒醅则香气稍淡、入口辛辣且回味悠长。这两轮基酒的质量控制直接决定最终白酒产品的品质等级。然而，目前大多数研究聚焦于成品酒的风味化合物分析，对酒醅发酵过程中微生物群落结构功能及其与代谢产物形成机制的认知仍十分有限。

特别是关于两轮发酵如何筛选特异性微生物群落、这些群落如何通过代谢潜能差异影响阶段特异性风味物质形成等关键科学问题尚未系统阐释。解决这些问题对理解汾香型白酒风味形成机理、提升生产工艺控制水平具有重要理论价值和实践意义。为此，研究人员在《Food Chemistry: Molecular Sciences》发表了最新研究成果，通过整合宏基因组学和非靶向代谢组学技术，深入揭示了大茬与二茬酒醅中微生物群落演替规律及其与风味代谢物形成的关联机制。

研究团队主要采用了以下关键技术方法：从湖北襄阳某酒厂酿造车间随机分层选取24个发酵地缸（大茬和二茬各12个）采集酒醅样本；使用Illumina NovaSeq 6000平台进行鸟枪法宏基因组测序，通过Braken、HUMAnN3等工具进行物种和功能注释；采用UHPLC-Q Exactive HF-X轨道阱质谱系统进行非靶向代谢组学分析，通过Progenesis QI软件和HMDB数据库进行代谢物鉴定；运用LEfSe、STAMP等统计工具进行差异分析和相关性网络构建。

微生物群落多样性、组成和差异丰度类群分析表明：二茬酒醅的α多样性指数（InvSimpson、Shannon和Simpson指数）显著低于大茬酒醅（p < 0.001）。β多样性分析显示两组微生物群落结构存在显著差异（PERMANOVA p < 0.001）。酒醅微生物以细菌为主（99.23%），优势菌门为厚壁菌门(Bacillota，97.57%)。在属水平上，大茬酒醅中乳酸杆菌属(Lactobacillus，10.45%)、明串珠菌属(Leuconostoc，2.90%)、植物乳杆菌属(Lactiplantibacillus，2.22%)和缓慢乳酸杆菌属(Levilactobacillus，2.18%)相对丰度较高，而二茬酒醅中醋酸乳酸杆菌属(Acetilactobacillus，76.76%)显著富集。物种水平上，大茬以Lactobacillus acetotolerans(10.22%)为标志物种，二茬则以Acetilactobacillus jinshanensis(76.81%)为绝对优势种。LEfSe分析鉴定出17个差异细菌物种，其中Lactobacillus和Lactobacillus acetotolerans在大茬中LDA得分最高，而Acetilactobacillus和A. jinshanensis在二茬中最富集。

KEGG通路基于微生物基因的功能差异分析显示：两组酒醅在KEGG/MetaCyc通路上存在显著差异。大茬富集UMP生物合成、O抗原构建块生物合成和脂肪酸生物合成起始等通路，而二茬特征性地富集厌氧呼吸I（细胞色素c）通路。碳水化合物活性酶(CAZy)分析发现多个家族在组间存在差异：CBM91、GT80、GT2等家族在大茬中相对丰度较高，而CBM48、CBM5、CBM18等在二茬中富集。GH68和GH70与GH115、CBM5、CBM50、CBM48和AA5呈负相关。

酒醅代谢组学变化特征：非靶向LC-MS代谢组学在正负离子模式下共鉴定出719种代谢物，其中225种为差异表达代谢物(DEMs)，122种在二茬中相对丰度高，103种在大茬中富集。这些代谢物主要属于有机酸及其衍生物(28.09%)、脂质和类脂分子(25.28%)、苯丙素和聚酮化合物(22.47%)以及有机杂环化合物(11.24%)。10种代谢物仅在大茬中检测到（如麦芽八糖、二氢莫雷黄酮、紫云英苷、原花青素C1等），8种仅在二茬中检测到（如硬脂酸丙二醇酯、赖氨酰羟脯氨酸、牛磺石胆酸等）。

代谢物差异的KEGG通路富集分析：鉴定出的代谢物涉及20条KEGG二级通路。在代谢范畴内，最具代表性的术语包括其他次级代谢物的生物合成、氨基酸代谢、化学结构转化图和异生物素生物降解。DEMs的富集分析突出显示黄酮类生物合成和黄酮/黄酮醇代谢在大茬中富集，而嘧啶代谢在二茬中显著富集。在黄酮类代谢轴上，12种DEMs在组间存在差异，其中表没食子儿茶素在大茬中含量最高（p < 0.01）。对于嘧啶代谢，胞苷、L-谷氨酰胺和胞嘧啶差异显著，其中胞嘧啶在二茬中含量最高（p < 0.001）。

微生物群、CAZy功能与黄酮/嘧啶代谢物之间的关联分析：为探究微生物-代谢物相互作用机制，研究人员将平均相对丰度＞0.05%的物种与黄酮和嘧啶通路中的DEMs进行相关性分析。发现四种 taxa——Lentilactobacillus hilgardii、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus acetotolerans和Lactobacillus amylolyticus——与多种黄酮类化合物（山奈酚、芹菜素、牡荆素、橙皮素、表儿茶素、柚皮素、柚皮苷、圣草酚、木犀草素、根皮素、槲皮素、表没食子儿茶素）呈正相关，与胞嘧啶呈负相关，表明这些LAB与黄酮类富集和较低嘧啶水平存在关联。与群落分离一致，Acetilactobacillus jinshanensis（二茬富集）与Lactobacillus acetotolerans、Levilactobacillus brevis和Lactiplantibacillus plantarum（大茬富集）呈强负相关。Mantel和Pearson分析进一步支持了差异丰度类群、CAZy家族和代谢物之间的显著关联。值得注意的是，黄酮类相关DEMs与CAZy谱的整体关联性强于与单个物种丰度的关联，表明碳水化合物活性功能可能比单独的分类学更能捕捉大茬和二茬之间的代谢物差异。

基于酶-分类群的代谢潜能和通路重建：根据这些关联性，研究人员基于宏基因组检测到的基因绘制了白酒发酵主要阶段（淀粉/纤维素降解、乙醇形成和酯类生产）的关键通路和酶-分类群联系图。高粱直链淀粉/支链淀粉主要被α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)和β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)水解。β-淀粉酶基因仅在Lactiplantibacillus plantarum中检测到，而α-淀粉酶基因由Bacillus haynesii、Lactiplantibacillus plantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus paralimentarius和Streptomyces albus携带。在这些携带者中，Lactiplantibacillus plantarum在大茬中占主导地位，而Bacillus haynesii在二茬中占主导地位。高粱纤维素可被纤维素分解酶（如内切葡聚糖酶，EC 3.2.1.4）水解，这些酶主要与Bacillus haynesii相关。对于酒精发酵，乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)和醛还原酶(EC 1.1.1.2)基因普遍存在，主要携带者包括Levilactobacillus brevis、Saccharomyces cerevisiae、Bacillus haynesii、Lactiplantibacillus plantarum和Staphylococcus succinus。乙醇、乙酸和乳酸随后可作为乙酸乙酯和乳酸乙酯形成的前体。羧酸酯酶(EC 3.1.1.1)是酯化作用中的代表性酶，主要与大茬中的Leuconostoc pseudomesenteroides和Levilactobacillus brevis以及二茬中的Bacillus haynesii相关。总体而言，大茬表现出以LAB为中心的碳水化合物利用和酯化潜能，而二茬显示出更强的与Bacillus相关的淀粉/纤维素水解以及乙醇/酯形成能力。

研究结论与讨论部分归纳：本研究通过宏基因组和代谢组分析首次系统揭示了汾香型白酒两轮发酵过程中酒醅微生物群落结构、功能特征和代谢物组成的变化规律。研究发现二茬酒醅微生物α多样性显著低于大茬酒醅，这与先前对汾酒厂发酵酒醅微生物群落结构的研究结果一致，可能归因于营养限制和发酵温度降低等环境因素。细菌是酒醅中的主要微生物，Lactobacillus acetotolerans是大茬组中最丰富的物种，而A. jinshanensis是二茬组中最丰富的物种。乳酸菌能够耐受低氧、低pH和高酒精环境，通常代谢乳酸、乙醇和其他化合物。这些微生物的代谢过程创造的酸性环境也可以抑制病原菌、腐败菌和产毒菌的繁殖。Acetilactobacillus是2020年发现的新LAB属，A. jinshanensis是该属的模式种和唯一鉴定菌株。近期研究表明A. jinshanensis广泛分布于食醋、浓香型白酒和酱香型白酒等发酵体系中。证据表明，与Lactobacillus acetotolerans相比，A. jinshanensis可能更适合二茬酒醅中的高酒精和低氧条件。

代谢组学研究表明大茬的代谢组组成与二茬不同。代谢物谱的差异通常与发酵轮次间微生物群落组成（如分类相对丰度和α/β多样性）和功能潜能（如宏基因组通路和CAZy基因谱）的变化相关。通过UHPLC-MS，共鉴定出719种代谢物，其中225种被确定为大茬和二茬组间的DEMs。通过代谢物的KEGG通路富集分析，发现45种DEMs与氨基酸代谢相关。氨基酸在真菌群落的确定性组装中起着重要作用，并影响白酒的风味化合物。与二茬酒醅不同，大茬酒醅富集了13种黄酮类及其前体。类黄酮和有机酸等天然多酚因其抗辐射、抗氧化、抗衰老和抗菌特性以及其他生物活性而引起了极大关注。这些化合物还被发现具有降血压和降血脂作用。

基于微生物物种与DEMs之间观察到的关系，以及与该物种和代谢物相关的CAZY注释，研究人员观察到LAB，特别是Lactobacillus acetotolerans和A. jinshanensis，是汾香型白酒发酵后期最活跃的微生物。先前的研究表明，酯类和醇类在第98天的酒醅中含量最高，与Lactobacillus群落的演替呈强正相关。汾香型白酒的发酵涉及淀粉液化、糖化、酒精发酵和风味物质形成。本研究结果表明不同的LAB菌株参与了发酵的不同阶段。Lactiplantibacillus plantarum产生大量参与淀粉降解的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，是大茬酒醅淀粉液化的主要参与者。然而，Bacillus haynesii在二茬酒醅的淀粉液化过程中很大程度上取代了Lactiplantibacillus plantarum，这可能与二茬酒醅中pH恢复有关。同时，研究人员还发现Bacillus haynesii是纤维素分解酶(EC 3.2.1.4)的主要生产者。近期研究证明了Bacillus haynesii强大的纤维素分解能力，这源于所有三种纤维素分解酶（内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶）的酶活性。Levilactobacillus brevis和Saccharomyces cerevisiae可提供多种酶，包括醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)、酒精脱氢酶(EC 1.1.1.1)和酒精脱氢酶(NADP(+)) (EC 1.1.1.2)，这些酶参与酒醅中的酒精形成。将本土Levilactobacillus brevis和酵母密集接种到汾香型白酒发酵体系中可以增强固体发酵的控制并加速发酵过程。此外，LAB与酒醅和白酒中酸、酯、醇和其他微量化合物的含量呈正相关，在风味物质的形成中起关键作用。在本研究中，Lactobacillus acetotolerans和Lactiplantibacillus plantarum为酒醅中乙酸和乙酸乙酯的形成提供了编码酶（如L-乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)和乙酸激酶(EC 2.7.2.1)）的基因。用Lactobacillus acetotolerans进行强化发酵可以显著促进白酒中乙酸乙酯和乳酸乙酯的形成。

综上所述，本研究首次对宏基因组和代谢组数据进行了全面分析，以研究汾香型白酒发酵不同阶段酒醅中核心微生物的进化及其风味形成机制。研究发现LAB，特别是Lactobacillus acetotolerans，是汾香型白酒后期发酵过程中的优势细菌。这些微生物在促进淀粉糖化以及酯、酸、醇和其他风味化合物的生产中起着至关重要的作用。这些发现为了解汾香型白酒生产各个阶段观察到的质量差异提供了宝贵见解，有助于增强勾调技术并提高整体酒质。这项研究对于提高汾香型白酒的生产质量和工业发展具有重要意义。