开发基于PCR、qPCR与LAMP技术的犬猫粪便中曼氏迭宫绦虫（Spirometra mansoni）分子检测方法及其应用评价

为解决曼氏迭宫绦虫（S. mansoni）在终末宿主粪便中缺乏分子检测方法的难题，本研究开发了PCR、qPCR与LAMP三种检测体系。结果显示，三种方法均具高灵敏度（LAMP达7.47 pg/μL）和强特异性，且对样本保存条件和采样位置不敏感，适用于现场快速筛查与早期诊断，为预防人兽共患裂头蚴病（sparganosis）提供关键技术支撑。

　　

曼氏迭宫绦虫（Spirometra mansoni）是一种重要的人兽共患寄生虫，其成虫主要寄生在犬、猫等终末宿主肠道中，而幼虫（裂头蚴）可感染人类及其他脊椎动物，引起裂头蚴病（sparganosis）。该病主要通过食用含幼虫的生肉或饮用受污染的水传播，临床表现包括幼虫移行症、失明、肢体瘫痪甚至死亡。东亚和东南亚地区是裂头蚴病的高发区，中国报告的病例数居全球首位。然而，由于裂头蚴病多为散发病例且缺乏关注，它长期被视为一种被忽视的寄生虫病。

目前，对曼氏迭宫绦虫感染的诊断主要依赖传统的粪便显微镜检查，该方法灵敏度低、检出率有限，难以实现早期诊断和大规模流行病学调查。虽然免疫学方法（如ELISA）操作简便，但存在交叉反应和假阳性问题。此外，从犬、猫等终末宿主采集血清样本困难，不利于大规模筛查。分子检测技术如PCR、实时荧光定量PCR（qPCR）和环介导等温扩增（LAMP）因其高灵敏度、强特异性和操作便捷性，在寄生虫病诊断中应用日益广泛，但尚未有针对终末宿主粪便中曼氏迭宫绦虫的分子检测方法报道。

为此，郑州大学寄生虫学教研室的研究团队在《Food and Waterborne Parasitology》上发表了一项研究，旨在开发并评估三种分子检测方法（PCR、qPCR和LAMP），用于检测犬猫粪便中的曼氏迭宫绦虫，并优化其反应条件、分析灵敏度、特异性及实际应用价值。

为开展本研究，作者团队从长沙地区的乌梢蛇（Zaocys dhumnades）体内分离裂头蚴，并通过线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（cox1）基因分型鉴定为曼氏迭宫绦虫。通过实验感染猫获取成虫及虫卵，采集不同感染时期（阴性组、早期感染组和中晚期感染组）的粪便样本，并系统评估了采样部位、保存温度（37°C、25°C、4°C、-20°C、-80°C）和时间（1周至6个月）对检测结果的影响。DNA提取分别采用粪便基因组DNA提取试剂盒和常规基因组DNA提取试剂盒。

在技术方法上，研究团队主要运用了以下三种分子生物学技术：

1. 1.

   普通PCR：以线粒体cox1基因为靶标，设计特异性引物，通过凝胶电泳分析扩增产物。

2. 2.

   实时荧光定量PCR（qPCR）：以cyt b基因为靶标，使用TaqMan探针法，优化引物、探针和Mg²⁺浓度以及退火温度，构建标准曲线并评估扩增效率、检测限和重复性。

3. 3.

   环介导等温扩增（LAMP）：针对cyt b和nad5基因设计多组引物，通过荧光染料法和pH指示剂（中性红）可视化法实现扩增检测，优化反应温度和内外引物比例。

此外，研究还进行了特异性验证，选取了犬猫粪便中常见的其他寄生虫（如细粒棘球绦虫、华支睾吸虫、钩虫等）的DNA作为对照，并通过218份现场采集的犬猫粪便样本进行初步流行病学调查。

3.1. PCR检测体系的建立与优化

通过比较6组引物，最终选择cox1F1R1引物进行后续实验，因其特异性高且与参考基因一致性达99.64%。灵敏度测试显示，PCR对虫卵DNA和粪便DNA的检测限分别为0.7 ng/μL和1.4 ng/μL。早期感染组中，PCR在感染后第9天即可检出阳性，比直接涂片法提前2天。不同采样部位（两端外侧、两端内侧、中间外侧、中间内侧）对检测结果无显著影响。样本在37°C保存时，条带亮度随保存时间延长而下降，而在25°C、4°C、-20°C和-80°C下保存180天后仍能有效检测。

3.2. qPCR检测体系的优化与评价

通过优化引物浓度（0.4 μM）、探针浓度（0.5 μM）、Mg²⁺浓度（2.0 mM）和退火温度（60°C），建立了高灵敏度的qPCR体系。标准曲线显示，扩增效率为107.625%（R² = 0.997），检测限为100 copies/μL。批内和批间变异系数（CV）均小于5%，表明方法重复性好，适用于定量检测。

3.3. LAMP检测体系的建立与性能分析

针对cyt b基因设计的引物在62°C、内外引物比例8:1时扩增效果最佳。荧光染料法和中性红可视化法均显示，LAMP对粪便DNA和裂头蚴DNA的检测限分别为7.47 pg/μL和355.5 fg/μL，灵敏度较普通PCR提高100倍以上。扩增时间在35分钟内，且无需复杂仪器，适合现场快速检测。

3.4. 特异性验证

PCR、qPCR和LAMP均未与细粒棘球绦虫、华支睾吸虫、钩虫、日本血吸虫、旋毛虫、弓形虫、贾第鞭毛虫和隐孢子虫等常见寄生虫发生交叉反应，表明三种方法具有高度特异性。

3.5. 现场样本检测

对218份犬猫粪便样本（包括宠物犬猫、流浪犬猫及动物园中的虎、狮、狐等动物样本）进行检测，三种方法均未检出曼氏迭宫绦虫阳性，提示该地区当前感染率较低或样本量不足。

4. 讨论与结论

本研究成功建立了针对曼氏迭宫绦虫的PCR、qPCR和LAMP分子检测体系，均具有高灵敏度、强特异性和良好的稳定性。其中，LAMP技术操作简便、检测快速，尤其适合资源有限的现场环境；qPCR能够实现定量分析，适用于感染负荷评估和传播动力学研究；普通PCR则可作为基础实验室的确认方法。此外，研究还证实粪便样本的保存条件和采样部位对检测结果影响较小，进一步提升了这些方法的实用性。

尽管现场调查中未发现阳性样本，可能受限于样本来源和规模，但本研究为曼氏迭宫绦虫的早期诊断、流行病学监测及裂头蚴病的防控提供了关键技术支撑。未来需在更广泛地区和大样本量中进一步验证这些方法的适用性，并加强其与其他绦虫物种的交叉反应验证，以确保其在复杂环境中的可靠性。总体而言，该研究推动了人兽共患寄生虫病的分子诊断技术进步，具有重要的公共卫生意义。