综述：猫弓形虫病的综合诊断方法：传统技术与新兴技术的融合

本综述系统探讨了猫弓形虫病诊断技术的演进与融合，涵盖血清学检测（如ELISA、MAT、IFAT）、分子诊断（如qPCR、LAMP、CRISPR/Cas9）及纳米材料（如PLGA、金纳米颗粒）应用。重点分析了各方法的敏感性与特异性，提出多技术联用和人工智能（AI）辅助诊断是未来提升精准检测（如阶段特异性抗原GRA7/SAG1）的关键方向，对阻断人兽共患传播链具有重要意义。

　　

摘要

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种全球分布的专性细胞内寄生虫，猫科动物作为其终末宿主，通过排泄卵囊在环境污染中发挥核心作用。准确及时的猫感染诊断对中断传播链和减轻公共卫生风险至关重要。本综述整合了当前与新兴的猫弓形虫病诊断策略，涵盖血清学检测、分子方法及纳米材料增强技术，并强调人工智能（AI）与机器学习（ML）在提升诊断精度、实现阶段特异性检测和个性化干预方面的潜力。

引言

弓形虫病是由T. gondii引起的人兽共患感染，可感染几乎所有温血动物。其生命周期包括两个关键阶段：仅在猫肠道内进行的有性繁殖和在中间宿主或猫体内进行的无性繁殖。猫摄入组织包囊或卵囊后，部分寄生虫分化为缓殖子（bradyzoites）形成组织包囊，另一部分侵入肠上皮细胞进行有性繁殖并产生未孢子化卵囊。这些卵囊排泄后在外界环境中孢子化成为感染性卵囊。人类感染主要通过摄入污染水源、食物或土壤中的孢子化卵囊，或食用未煮熟的含组织包囊的肉类。猫作为关键宿主在寄生虫传播动态中居核心地位，凸显对其群体进行靶向监测的必要性。

流行病学数据显示，T. gondii流行率存在显著地区与宿主差异：家猫血清阳性率约35%，野生猫科动物则超过59%。全球约2%的猫活跃排泄卵囊，加剧环境污染。因此，针对猫宿主的改进监测与诊断措施对降低环境卵囊污染和传播风险至关重要。

诊断方法

血清学检测

酶联免疫吸附测定（ELISA）

ELISA基于抗体与抗原的特异性结合，通过酶标记二抗放大信号，实现高灵敏度和特异性检测。其成本低、可规模化，适用于早期诊断（如IgM检测）。常用重组抗原包括表面抗原1（SAG1）、致密颗粒抗原7（GRA7）、免疫映射蛋白1（IMP1）和顶膜抗原。但溶血或高脂样本可能导致假阳性/假阴性，且抗体量少时易漏检。

改良凝集试验（MAT）

MAT通过抗原-抗体复合物形成可见凝集反应，灵敏度高，可检测低浓度抗体，适用于早期感染。其操作简便快速，但无法区分近期与既往感染，需参考样本或互补方法确认。

间接荧光抗体试验（IFAT）

IFAT利用荧光标记二抗检测血清抗体，灵敏度与特异性高，可半定量分析，但技术要求高、结果易变。与ELISA联用可优化检测流程并降低成本。

免疫层析试验（ICT）

ICT基于抗原-抗体结合原理，无需复杂设备，30分钟内即可获得结果，适用于现场诊断。但早期感染易假阴性，仅限定性分析。商用试剂盒（如FASTest? TOXOPLASMA g）性能与传统方法相当。靶向抗原如SAG2、GRA7已用于猫检测。

金免疫层析试纸条（GICA）

GICA利用金纳米粒子标记抗体/抗原，通过肉眼观察色移快速判读。基于AMA1的GICA灵敏度与特异性优于GRA7，且结合数字化评估可减少人为误差。

时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）

TRFIA采用镧系离子铕（Eu³⁺）等长寿命荧光标记，通过延迟测量降低背景干扰，显著提升灵敏度。嵌合抗原（如SAG1-GRA8）比单一抗原表现更优，为其他免疫 assay 提供改进方向。

抗原与分子诊断

聚合酶链反应（PCR）与进阶PCR

PCR通过扩增特定DNA序列（如B1基因、REP-529重复元件）检测T. gondiiDNA，灵敏度与特异性高，可区分菌株。实时定量PCR（qPCR）和巢式PCR进一步提升了灵敏度与定量能力。qPCR在尸检组织分析中优于MAT，且可区分T. gondii与Hammondia hammondi。但PCR需专业设备与人员，限制其现场应用。

环介导等温扩增（LAMP）

LAMP在恒温（60–65°C）下通过链置换DNA聚合酶扩增DNA，可通过荧光染料或浊度变化可视化结果。靶向529-bp序列的LAMP与侧流层析（LFD）联用显示优异性能，但仅适用于早期感染。近期研究将重组蛋白（如SAG1、SAG2）与LAMP结合，提升检测准确性。

RPA-CRISPR/Cas9技术

该技术结合重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas9系统，靶向T. gondii529-bp片段，通过侧流试纸条可视化结果。RPA无需热循环，CRISPR/Cas9提供精确DNA切割，为现场诊断提供快速、灵敏的替代方案。

纳米材料在诊断中的应用

可生物降解共聚物如聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）作为药物/疫苗递送系统展示潜力：封装rSAG1的PLGA纳米颗粒经鼻免疫可激发体液免疫；rROP18PLGA纳米颗粒诱导显著保护性免疫；壳聚糖-PLGA递送的DNA疫苗可激发细胞与体液免疫。纳米材料还用于诊断平台，如碳纳米纤维与金纳米粒子增强电化学信号，提升血清检测灵敏度。

诊断效能评估

比较研究

血清学方法中，IFAT需实验室条件；ELISA可现场定性但定量需实验室；ICT与MAT适用于现场；分子方法（PCR、LAMP、CRISPR/Cas9）虽灵敏度高但受限于设备与技术。整合多技术（如血清学初筛+分子确认）可提升诊断全面性与准确性。

地域案例研究

巴基斯坦研究显示流浪猫感染率显著高于家猫，且年长猫更易呈现慢性症状；哥伦比亚与美国调查强调流浪猫群体与人类感染的高关联性；马来西亚采用多拷贝靶标PCR（B1/REP基因）显著提升检测灵敏度。这些发现支持对高风险群体（如流浪猫、老年猫）优先筛查。

诊断工具对疾病控制的影响

血清学检测（IgG/IgM）与分子技术（PCR）联用可早期识别感染猫，通过隔离治疗减少卵囊排泄，从而限制通过空气、水源或食物的传播。对免疫缺陷人群与孕妇，猫群体管理至关重要。目前尚无有效商用猫疫苗，但鼻内接种棒状体蛋白（如rROP2）可减少卵囊排泄，凸显早期诊断与治疗对中断传播链的价值。

诊断研究新方向

先进技术整合

人工智能（AI）与机器学习（ML）可分析血涂片与组织切片图像，自动识别T. gondii形态特征，减少人工误差与漏诊。AI还能整合病原体毒力与宿主免疫参数，支持预测模型开发与跨学科数据共享，提升诊断效率。

综合诊断面板开发

依赖单一方法易假阳性/假阴性。多技术联用（如血清学+分子+免疫层析）可显著提升准确性。限制性片段长度多态性（RFLP）与桑格测序可区分感染基因型；ELISA与MAT适用于大规模初筛；ICT提供快速现场结果；PCR用于确认。这种策略为早期诊断与防控提供技术支持。

诊断协议标准化

建立统一指南对筛查、诊断与监测的一致性至关重要。无症状猫建议血清学初筛，结果不明确时用PCR确认。样本收集、运输与存储需严格协议以确保准确性。诊断解读应基于血清学与分子方法综合评估，并建立标准化结果判读标准。感染猫需根据临床症状与健康状态治疗，无症状者定期监测。野生动物因暴露风险高需更严密监控，地方性区域建议定期抗体筛查。集中数据库可支持长期研究与公共卫生倡议。

展望

当前多数诊断方法依赖实验室设施与人员，限制其现场应用。未来需开发快速、用户友好的工具以适应多样环境。现有方法存在交叉反应性与检测效率低等挑战，需聚焦早期感染高特异性抗原或多抗原靶标策略提升准确性。分子与血清学技术整合与AI辅助可推进诊断精度，AI可推断感染阶段以指导治疗。近期研究显示许多抗原蛋白在裂殖生殖中期与晚期表达一致，反映当前实验模型（如小鼠）主要支持速殖子、缓殖子与组织包囊阶段研究，对裂殖生殖阶段基因了解有限。针对猫早期感染，裂殖生殖、孢子化卵囊与缓殖子阶段最关键，需优先开发这些阶段高表达基因的血清学 assay，当前缓殖子与孢子化卵囊阶段已有高表达蛋白，但裂殖生殖相关特异性蛋白少且表达低，需深入研究。