多重组学与细胞形态学揭示耐药单核细胞增生李斯特菌应激反应机制的新见解

本综述通过整合转录组学（RNAseq）和蛋白质组学技术，结合细胞形态学分析，系统阐述了耐药单核细胞增生李斯特菌（SR-Lm）在多重应激（pH 3?+?1?°C?+?5%盐）条件下的分子应答机制。研究发现关键基因（如yebS、secA、gap）和蛋白（如Gap、Eno、CysK）显著上调，并揭示了伴侣蛋白、糖酵解及谷氨酸脱羧酶系统（GAD）等通路在应激适应中的核心作用，为食品加工中病原菌防控提供新视角。

　　

引言

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes, Lm）是一种广泛存在于土壤、水源及多种食品（如乳制品、即食食品、肉类和蔬菜）中的病原体，可引发李斯特菌病，每年在美国导致约1,600例住院和260例死亡。该菌能在酸性、低温和高盐等恶劣环境中存活，对食品安全构成严重威胁。根据既往研究，李斯特菌可分为应激敏感型和应激抵抗型（SR-Lm）菌株，后者在应激条件下存活能力显著更强。尽管已有研究探讨了李斯特菌的应激响应，但结合转录组和蛋白质组学分析SR-Lm在多重应激条件下的分子机制仍较为有限。

材料与方法

研究选用从食品中分离的SR-Lm BL42菌株，在正常（37?°C）和多重应激条件（pH 3?+?1?°C?+?5%盐）下培养，并于4、8、12、24和48小时收集样本进行转录组学分析。蛋白质组学分析则在三种应激条件下进行：5%盐+1?°C、pH 3?+?1?°C，以及pH 3?+?1?°C?+?5%盐，培养4和12小时后取样。RNA提取使用RNeasy Micro Kit，建库后通过Illumina NextSeq 2000进行测序，数据经STAR和StringTie处理，以TPM（转录本每百万）值量化基因表达，log₂FC（折叠变化） cutoff设为±1。蛋白质提取采用B-PER试剂，经胰酶消化后通过Orbitrap Fusion Lumos质谱仪分析，蛋白质鉴定和定量基于UniProt Lm EGD数据库。细胞形态通过扫描电子显微镜（SEM）观察。数据统计分析使用R Studio，GO和KEGG通路分析利用相应在线工具完成。

结果

死亡曲线显示，SR-Lm在48小时内，应激条件下的活菌数仅下降不足1 log CFU/mL，与对照组无显著差异，表明其极强的应激耐受能力。

转录组学分析共识别751个转录本，包括689个mRNA。差异表达基因数量在48小时内呈动态变化，上调基因数介于88至229之间，下调基因数介于190至357之间。热图分析显示，yebS、secA、tsx、gap和ycdX等基因在多重应激条件下显著上调。已知应激相关基因如盐应激基因spxA和冷休克基因cspB/cspD从4至48小时持续上调，酸应激基因atpD在24小时表达达峰。RT-qPCR验证了6个基因的表达趋势，与RNAseq结果高度吻合（R2=0.748）。

蛋白质组学分析鉴定到1,034个蛋白质。差异表达蛋白数量范围：上调95-391个，下调77-1,022个。火山图显示，酸和多重应激条件下4小时以下调蛋白为主，而12小时所有条件均出现显著上调蛋白。热图突出显示核糖体蛋白（如RplD、RplV）、Gap、Fri、Eno和CysK等在不同应激和时间点一致上调。

GO分析表明，氧化还原酶活性、ATP酶相关活性、DNA损伤响应等功能在两组学数据中均显著富集。KEGG通路预测基于蛋白质组数据，显示σB因子在应激响应中激活，进而调控伴侣蛋白（GrpE、GroES、GroEL）和毒力因子（PrfA）。核糖体蛋白（RplC、RplD、RplW）、组氨酸生物合成、磷酸转移酶系统（PTS）、谷氨酸脱羧酶系统（GAD）、脂磷壁酸和脂肪酸生物合成相关蛋白均出现上调。盐应激特有上调蛋白涉及果糖PTS、渗透保护物转运系统（GbuAB、OpuCAD）及甘氨酸和血红素相关蛋白。酸应激下组氨酸生物合成、半乳糖醇代谢和毒力因子PlcA/PlcB相关蛋白上调。

SEM图像显示，正常条件下细胞呈聚集和生物膜形态；盐应激下形态接近正常；而酸和多重应激下细胞显著伸长、表面粗糙，出现小簇状可能为胞外聚合物（EPS）结构。细胞形态变化与细胞形状蛋白（如MreC）和肽聚糖合成蛋白（MurB、MurF）的表达改变相关。

讨论

SR-Lm在应激条件下存活能力稳定，与既往研究一致。转录组和蛋白质组分析揭示了多个新颖的应激响应机制。yebS（内膜转运蛋白，关联氧化应激）和tsx（核苷通道蛋白）的上调在李斯特菌中较少报道。secA（蛋白转运）的持续上调可能促进应激下蛋白的正确折叠和定位。gap和gtfA（能量代谢）的上调表明SR-Lm通过增强能量生产以维持pH稳态。

已知应激通路如σB（sigB）、应激体和毒力连接在本研究中得到验证。σB的波动性表达与其在酸应激中的核心作用一致。半胱氨酸合成酶（cysK）和硫氧还蛋白（trxA）的上调提示它们在维持细胞氧化还原平衡中的潜在作用。

KEGG通路整合表明，应激信号通过σB激活，驱动伴侣蛋白、核糖体蛋白和代谢通路的重编程。碳代谢和PTS系统（如LMON_2487、2688）及纤维二糖代谢（LMON_1784、1785）的上调，使菌株能利用替代碳源。ATP生产、质子消耗、氨中和以及未表征应激蛋白（LMON_1669、2770）可能共同促进应激生存。脂磷壁酸和脂肪酸蛋白（如LMON_2718、FadG）的上调暗示细胞膜的重塑和修复。

盐应激特有的应答涉及果糖PTS、渗透保护物转运（GbuABC、OpuCAD）及氨基酸代谢，强调相容性溶质在盐适应中的关键性。酸应激下组氨酸生物合成的上调是一种新发现的机制，可能与酸中和有关。GAD系统（LMON_2376）在多重和盐应激下上调，通过消耗H⁺和产生能量（GABA代谢进入TCA循环）增强酸耐受。多重应激可能触发更综合且能量高效的生存策略。

GO术语如氧化还原酶活性、电子传递链、核糖体功能、DNA损伤响应和伴侣功能，凸显了它们在应激下维持蛋白稳定性、管理活性氧（ROS）、增强蛋白合成及保护基因组完整性中的作用。ATP相关功能的富集与细菌应激研究一致。转录与蛋白水平的差异可能源于转录后调控和方法学差异。

细胞形态改变与既往研究一致。伸长和粗糙表面可能与DNA损伤修复机制（如错误倾向聚合酶）及细胞壁合成蛋白（如MreC、MurB）的表达变化相关。酸和多重应激下生物膜样结构的出现可能是菌群保护策略的一部分。细胞形状相关基因（如MreB、MreC）的下调可能直接导致形态异常。DNA复制基因（如dnaB）的下调可能与应激下DNA损伤和复制抑制有关。

本研究首次通过整合多组学和形态学分析，系统揭示了SR-Lm的应激应答网络，包括能量生产、质子消耗、氨中和及细胞壁重塑等机制，为理解食源性病原体在恶劣环境中的生存策略提供了分子基础，对开发新型防控措施具有重要启示。