单甘酯基复合生物防腐涂层对冷藏禽肉微生物安全性的协同保鲜机制研究

本综述系统探讨了以单甘酯为基质的可食性膜形成复合物（FFC）结合乳酸、乳酸链球菌素（nisin）及重组菌源抗菌肽（LGS）对冷藏禽肉（0–2°C）的防腐效果。研究通过多屏障技术（hurdle technology）显著抑制微生物生长，降低pH与氧化还原电位（Eh），延长保质期，为替代合成防腐剂提供了天然解决方案。

　　

摘要

研究评估了在单甘酯基涂层中加入乳酸和由乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ssp. lactis）合成的细菌素（包括nisin和来自重组菌株F-116的LGS制剂）对冷藏禽肉（0–2°C）微生物安全性的提升效果。实验同时分析了生物防腐剂对涂层活性酸度（pH）和氧化还原电位（Eh）的影响，并通过光学与电子显微镜观察了涂层在贮藏期间的结构变化。结果表明，结合脂质基质、有机酸和细菌素的多组分配方遵循“栅栏技术”原则，各因素协同发挥防腐作用。此类涂层与冷藏结合，是维持冷藏禽肉品质和延长货架期的有前景的合成防腐剂替代方案。

引言

动物源性产品的质量在全球范围内备受关注，尤其是在人为因素对环境、农作物和畜牧生产影响日益加剧的背景下。技术、生物技术及食品微生物安全是产品质量与安全的关键组成部分。近年来，由于禽肉的经济性、高营养价值和膳食特性，其全球产量和消费量持续增长。

消费者对肉制品品种、质量和保质期的要求不断提高，国内禽肉市场显著扩大且竞争加剧。据联合国粮农组织（FAO）预测，全球禽肉年产量将达1.27亿吨，成为最大的肉类蛋白来源；到2030年，禽肉预计占肉类蛋白总量的41%。然而，限制该行业经济效率的关键因素之一是贮藏过程中因微生物污染和氧化变质导致的质量损失。鲜肉冷藏是延缓自溶过程和防止腐败菌生长的常用方法，但传统的物理化学处理方法已过时，需结合当前科技进步进行现代化改进。

可食性膜与涂层技术的新方向应运而生，其富含天然抗菌物质，为保护生鲜和加工肉类提供了有前景的生物技术方案。抗菌成膜涂层可由蛋白质、脂质或多糖制成，并添加有机酸和细菌素作为活性成分。蛋白质基膜虽能良好附着于亲水肉表面并有效阻隔氧气和二氧化碳，但对水蒸气传递的阻隔性较差。相比之下，脂基可食膜采用多种疏水化合物（如动植物油脂、脂肪酸、单甘酯、二甘酯、三甘酯、乳化剂等），这些成分改善了耐水性、涂层基质内聚性及弹性，形成了优异的水分屏障，有助于保持产品特性。

当前，替代合成化学防腐剂的新保鲜技术研发正积极开展。生物防腐——利用天然微生物或其抗菌代谢物延长食品保质期——被视为一种重要方法。乳酸菌（LAB）是产品开发、医疗保健和食品安全领域中科学知识和创新应用的丰富来源。其抗菌作用主要源于介质酸化（降低pH）、营养竞争和抑制性代谢物的产生。其中，细菌素作为核糖体合成的抗菌肽，具有特殊地位；它们可被胃肠道蛋白酶降解为氨基酸，且不诱导病原微生物耐药性。

研究最广泛的细菌素是乳酸链球菌素（nisin），这是一种羊毛硫抗生素，自1998年起被认定为“公认安全”（GRAS）。Nisin在40多个国家被批准为食品添加剂E234，用于多种食品。它对革兰氏阳性菌（包括致病性和产孢菌）具有显著活性，其作用机制与破坏细胞膜通透性相关。然而，nisin对革兰氏阴性菌和真菌效果有限，而冷藏禽肉的腐败微生物多以革兰氏阴性菌（如假单胞菌属）以及酵母和霉菌为主。这一局限性促使人们寻找更高效、经济的天然抗菌剂。

大规模生产nisin面临产量和成本效益的挑战。现有工业菌株产量低，产品不稳定，对环境条件敏感，合成过程扩展性有限。通过基因改造和优化生物合成条件，重组乳酸乳球菌菌株可显著提高产量。通过原生质体融合获得的重组菌株乳酸乳球菌F-116具有高nisin产量，并基于此开发了LGS细菌素制剂，其抗菌谱更广，可抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌和酵母。

nisin的抗菌作用可通过与其他抗菌剂（如其他细菌素、有机酸和表面活性剂）联用增强。开发多组分保护涂层时，需考虑关键栅栏因子，如温度、pH、氧化还原电位（Eh）、水分活度等。肉类冷藏期间相关微生物生长的最低pH值通常在3.2至5.3之间，将产品表面pH维持在此阈值以下可显著抑制微生物发展。氧化还原反应（通过Eh电位测量）也影响肉类贮藏期间的品质和稳定性；Eh降低通常减缓好氧腐败菌生长并延迟脂质和蛋白质的氧化降解，从而延长保质期。

本研究旨在探究基于蒸馏单甘酯的食品涂层，加入乳酸和细菌素（nisin与LGS制剂）对冷藏禽肉微生物安全性的影响。

材料与方法

研究对象为来自工业生产商（莫斯科州Petelinskaya家禽厂）的肉鸡半胴体，其质量符合GOST 31962-2013对冷藏鸡肉的要求。样品购自零售店，按温度 regime 分类为“冷藏”。实验使用5个半胴体作为对照组和实验组。

涂层配方以工业组合物PPS-10（下诺夫哥罗德油脂厂）为基础，包含蒸馏单甘酯（E471）和乙酰化蒸馏单甘酯，形成脂质基质。向此基础中添加乳酸（GOST 490–2006）、nisin和细菌素，浓度为0.025%（w/v）（相当于250 ppm活性nisin），符合GOST R 57646–2017对食品级nisin的要求。

为确定乳酸最佳浓度，对照组1用不含乳酸的PPS-10基础涂层处理，实验组用含0.5%、1.0%、1.5%和2.0%（v/v）乳酸的涂层处理。0.5%浓度依据文献推荐，2%为最高允许水平，超过此浓度会导致禽皮出现白斑，降低商业品质。为识别2%乳酸在基础涂层中的可能协同效应，对照组2用2%乳酸水溶液处理。

为评估乳酸浓度对微生物抑制的影响，用不同浓度乳酸配方处理的肉样在0–2°C和85–90%相对湿度下贮藏。微生物分析在处理前、涂层施用后6小时以及贮藏第3天和第5天进行。

乳清基PPS配方中仅加入0.2%柠檬酸以评估其对介质活性酸度（pH）和氧化还原电位（Eh）的影响。

为比较新型细菌素LGS（源自重组菌株乳酸乳球菌F-116）与商业nisin制剂（Nisaplin, Aplin & Barrett, LTD）的效果，两者均以0.025%浓度与2%乳酸（LA）联用，同时测试PPS-10加2%乳酸的处理。未处理半胴体作为对照。此实验系列中，对照组和每个涂层实验组使用3个半胴体进行微生物研究。

食品成膜组合物溶液通过手动喷雾器（Gigant IAG-013, 500 mL, 俄罗斯）在50±2°C下喷涂于禽胴体表面。研究在0–2°C和85–90%相对湿度下进行20天，每5–10天取样，检测样品的总细菌污染。

微生物分析通过标准平板法测定嗜温好氧和兼性厌氧微生物总数（CFU/g）（依据GOST 7702.2.1-2017）。取1g或25g肉样放入无菌试管，在处理前（基础微生物群）和贮藏期间进行洗涤样品接种，在Plate Count Agar上30°C培养72小时测定嗜温细胞总数。嗜冷菌在6–7°C培养10天计数。大肠菌群（大肠杆菌组）通过选择性培养基接种检测（类似ISO 4832），记录在0.01g样品中的存在/不存在。沙门氏菌属和李斯特菌单核细胞增生菌的存在使用标准方法监测（类似ISO 6579-1:2017和ISO 11290-1:2017）。额外监测了肉类产品典型污染物变形菌属的存在。所有微生物分析依据禽肉产品安全的卫生要求（SanPiN 2.3.2.1078-01）进行。

理化分析使用pH计（HANNA HI 991,300）测量涂层溶液的pH值。氧化还原电位（Eh）使用ORP电极在20°C下测定。测量在添加防腐剂前后进行，以评估有机酸和nisin的加入对pH和Eh值变化的影响。

涂层微观结构通过组织学和电子显微镜方法研究。溶液以流动层形式应用于无菌脱脂玻片。模型实验中，观察涂膜结构在施用后立即以及贮藏5天和10天（0–2°C）后的变化。

使用光学显微镜（Micromed 1, var. 2–20, LOMO公司, 圣彼得堡, 俄罗斯联邦）在400倍放大下检查薄膜。为评估涂层完整性和微孔存在，额外实验使用扫描电子显微镜研究成膜组合物表面结构。溶液滴加于金属网格基底，干燥并喷金后，在扫描电镜（SEM, Hitachi SU-8010, 日本）下5000倍放大观察。

实验数据使用Microsoft Excel和StatSoft Statistica 6.0（美国）进行统计处理。平均值间差异显著性通过Student t检验（p≤0.05）确定。

结果与讨论

多种防腐因子的结合是食品保鲜中“栅栏技术”概念的关键要素。有机酸作为天然抗菌成分，与其他剂联用，在确保肉制品微生物质量方面发挥重要作用。

研究表明，将有机酸盐（如乳酸盐、醋酸盐或丙酸盐）与nisin一同加入食品涂层可产生协同或抑制效应。例如，乳酸盐和nisin的添加抑制了冷藏肉中长期贮藏的单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长。

嗜温和嗜冷微生物的同步发展导致肉类快速腐败，尤其在变形菌属或嗜冷假单胞菌属占优势时。证据表明，冷却前嗜冷菌仅占肉类污染物总数的不到10%，而送达消费者时其比例可增至80%以上。

新鲜（未处理）肉鸡半胴体的初始微生物污染反映了冷藏禽肉的典型污染水平。在未处理并于0–2°C贮藏的对照样品中，5天内微生物数量迅速增加。革兰氏阴性杆菌（典型腐败微生物，如假单胞菌属）特别活跃，它们在肉蛋白胨琼脂上产生特征性绿色荧光，导致肉蛋白胨肉汤浑浊和膜形成，并引起Russell培养基颜色变化而无产气。这些微生物开始在对照样品微生物群中占主导，存活污染微生物总数随时间显著增加。相比之下，用抗菌涂层处理的样品中，微生物生长大幅减少。

总结数据显示了冷藏期间对照和处理样品中嗜冷菌和嗜温菌数量的变化。涂层施用后立即（贮藏6小时后），处理样品总微生物负荷较初始水平略有降低，表明乳酸的即时抗菌效应。

贮藏第3天，含乳酸（0.5–2%）涂层的样品中嗜冷菌数量显著低于未处理对照。即使最低乳酸浓度（0.5%）也抑制了嗜冷菌生长 relative to对照。较高乳酸水平（2%）在5天内将嗜冷菌抑制了2个数量级（8.6×10³ vs. 5.8×10⁵ CFU/g）。嗜温好氧菌也呈现类似模式：处理样品中总好氧菌生长远慢于对照。至第5天，对照样品嗜温菌数超过5 log CFU/g（表明腐败开始），而含1.5%和2.0%乳酸的涂层样品中仅为3–4 log CFU/g，显著低于腐败阈值。

因此，乳酸加入可食涂层配方显著延长了禽肉微生物货架期，体现为冷藏期间微生物负荷较低。然而，相同2%乳酸浓度在水和PPS-10配方中，5天贮藏后对微生物生长的抑制效应在PPS-10中比在水中高一个数量级，表明协同抑制效应。此效应对嗜冷微生物尤为明显。

研究期间，所有样品在整个贮藏期均未检出单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌属。实验数据分析表明，向基于蒸馏单甘酯及其乙酰化衍生物的成膜组合物添加2%乳酸导致pH最大降低（从7.85至2.67）。相反，在乳清基成膜组合物中加入2%乳酸和0.2%柠檬酸（作为抗氧化剂）仅引起pH较小降低（从4.75至3.17）。乳清基组合物pH降低较小是由于添加有机酸前乳清本身活性酸度较低。Nisin（0.025%）的加入仅对pH产生轻微附加影响（例如在一配方中从4.45降至3.05）。这些pH值低于文献报告的腐败菌生长阈值水平。

在保持食品品质和贮藏稳定性方面，氧化还原反应也起重要作用，可通过测量氧化还原电位（Eh）评估。有机酸加入可食成膜组合物（EFC）对Eh变化程度的影响取决于配方。所有三种可食成膜组合物的Eh值在129至158 mV之间。最大值158 mV见于“FFC 3% + LA 2%”组合物，最低Eh 129 mV记录于“乳清5% + 甘油10% + LA 2% + CA 0.2%”未加nisin的配方。

氧化还原电位直接影响微生物生长速率。支持微生物 intensive生长的Eh范围依其氧需求而异：好氧菌在+500 mV至+300 mV生长活跃，兼性厌氧菌在+300 mV至-100 mV thrive。实验结果表明，应用于禽胴体表面的测试可食涂层的Eh值低于贮藏期间好氧和兼性厌氧菌 active生长的典型值。Eh值越低，肉制品贮藏稳定性越高，因脂质和蛋白质氧化速率降低。

因此，通过创造有利理化条件（低pH和Eh）在肉表面形成的环境提供了有效防腐屏障，对大多数污染微生物群生长产生抑制效应。乳酸不仅降低表面酸度，还能穿透细菌细胞，破坏代谢过程并损伤细胞膜。相反，腐败中的肉类使反应介质向中性偏移，pH值达6.4–6.8或更高，取决于降解产物（主要是氨）的积累和贮藏期间肌肉组织的结构变化。

低Eh值还减缓肉类氧化反应，从而有助于保持品质（延迟酸败味和变色）。因此，通过同时降低肉表面pH和Eh，富含乳酸的涂层建立了高度不利于微生物增殖和氧化腐败的“双重屏障”。这 likely解释了研究中观察到的显著防腐效应——处理样品保持微生物稳定和感官可接受的时间长于未处理冷藏禽肉的典型期限。

细菌素（即nisin和LGS制剂）与不同浓度乳酸一同加入可食成膜组合物，对肉鸡半胴体初始微生物负荷和20天冷藏期间的影响数据显示，禽样初始污染水平为3.6×10³ CFU/g。贮藏期间微生物负荷逐渐增加：嗜温好氧和兼性厌氧微生物（MAFAnM）数量5天后增至2.5×10⁴ CFU/g，10天后达2.0×10⁶ CFU/g，至20天达最高水平7.2×10⁸ CFU/g，超出规定限值。肉类产生 unpleasant odor、变色和表面粘液，不再符合感官品质规范（SanPiN 2.3.2.1078-01）。因此，冷藏条件（0–2°C）下样品贮藏试验于20天终止。

使用含乳酸的PPS-10溶液（基于单甘酯）的实验变体中，微生物数量从3.1×10³增至5天后的2.7×10⁴ CFU/g，随后20天冷藏贮藏达3.7×10⁶ CFU/g。

用nisin处理的样品中，微生物生长速率较慢：贮藏5天后微生物负荷逐渐增加，10天后达1.1×10⁵ CFU/g，20天后为2.2×10⁶ CFU/g。用LGS细菌素处理的样品污染水平增加较温和，定植微生物总体生长速率较低，20天贮藏达3.6×10⁴ CFU/g。

用nisin和LGS细菌素处理后，总微生物负荷降低了两个数量级——从3.2×10³ CFU/g肉降至5天后的2.5×10² CFU/g relative to对照。然而，长期贮藏期间nisin对微生物群的抑制活性较LGS细菌素下降。nisin溶液处理肉样的总微生物污染在贮藏期间逐步增加，从2.2×10² CFU/g（第5天）至1.1×10⁵和2.2×10⁶ CFU/g（分别），而LGS细菌素处理样品中嗜温好氧和兼性厌氧微生物（AMFAnM）数量为3.6×10⁴ CFU/g。这些结果表明nisin在贮藏期间逐渐失活。

使用由乳酸乳球菌F-116生产的新型细菌素的实验变体中，总细菌负荷保持相对较高水平， due to引入的乳酸菌在贮藏头5天内继续增殖（嗜温好氧和兼性厌氧微生物数量从3.7×10³增至6.2×10³ CFU/g）。随后这些微生物逐渐减少；然而，贮藏过程中，产品总微生物负荷因对低温条件的适应和嗜冷型发展而再次增加。

需强调，LGS细菌基于重组菌株开发，是一种双组分细菌素，具有广谱抗菌活性。与常规羊毛硫抗生素不同，它不仅对革兰氏阳性菌有效，还对革兰氏阴性菌和微霉菌有效，这些构成易腐食品原料微生物景观的重要部分。

此外，乳酸菌（LAB）是冷藏肉中最常见的微生物之一。它们从土壤、空气和水进入肉制品。尽管LAB可引起某些类型腐败，但它们的有意应用——由于其强酸化环境能力——可抑制腐败微生物群生长，改善肉质构，甚至有助于 develop理想风味和颜色保持。

值得注意的是，本样品中未检出产孢或厌氧菌，包括梭菌属和其他致病型。该样品优势微生物群为乳球菌。样品色泽吸引人且无不良气味。

众所周知，在近5°C高湿条件下，可能发展链球菌属（肠球菌）、微球菌、明串珠菌、乳杆菌、气杆菌、假单胞菌、无色杆菌、变形菌、芽孢杆菌、葡萄球菌、八叠球菌以及酵母和霉菌。依据SanPiN 2.3 February 1078–01和相关规范文件，研究了样品 sanitary和细菌学状况 regarding致病微生物存在，包括大肠菌群（大肠杆菌组）、沙门氏菌和李斯特菌单核细胞增生菌。

研究表明，所有样品在整个贮藏期均未检出沙门氏菌属和李斯特菌单核细胞增生菌。对照样品和nisin处理样品中，10天贮藏后检出假单胞菌属。这些革兰氏阴性杆菌在营养琼脂（NA）上产生特征性绿色荧光，导致营养肉汤（NB）浑浊和膜形成，并改变Ressel半斜面琼脂底部颜色而无产气。

未处理肉鸡半胴体（无防腐处理）中，10天贮藏后检出肠球菌和厌氧腐败菌。这些微生物引起 unpleasant odor、变灰和表面粘液形成。用含乳酸的PPS-10处理的样品中，10天贮藏后观察到选择性增菌培养基（含NaCl的NB）中金黄色葡萄球菌生长，并通过阳性血浆凝固反应（PCR）确认。所有样品中均未检出厌氧产气菌，包括梭菌属或变形菌属、八叠球菌属。除LGS细菌素处理样品外，所有样品10天后均检出酵母。

可食涂层的重要特性是其在产品表面形成连续稳定薄膜的能力，并在贮藏期间保持结构完整性。薄膜中任何裂缝或孔洞都可能 facilitate微生物渗透以及水分和氧气交换，从而降低其有效性。就此，在模型样品上评估了涂层微观结构， immediately after应用于玻片以及长期贮藏（10天，0–2°C）后。

涂层在光学显微镜下（400×）立即施用后显示为均匀层，无可见裂缝或孔洞，表明良好初始完整性。扫描电子显微镜（SEM, 5000×）下立即施用后涂层表面 presented。10天冷藏贮藏后，涂层大部分保持对肉表面粘附，尽管观察到部分薄膜降解 signs。PPS在10天后的显微照片表明，尽管大部分表面覆盖保持，但局部区域出现薄膜破裂或 detachment。然而，即使10天后，单甘酯基组合物仍确保 substantial表面覆盖。此持久性对此类涂层在家禽业应用具有实践意义。

结论

总体而言，本研究结果证明了富含乳酸和细菌素nisin的可食涂层在增强冷藏禽肉微生物安全性和延长货架期方面的潜力。通过结合多种天然防腐因子（有机酸、细菌素和低温贮藏），实现了“多屏障” approach原则，有效抑制产品腐败而无须使用合成防腐剂。涂层所有组分均为食品级且公认安全，这 facilitates消费者接受。重要的是，处理对肉类感官特性无任何负面影响——相反，处理样品比未处理样品保持新鲜更久。

应用含乳酸和广谱细菌素LGS的保护性可食成膜涂层是延长冷藏肉鸡保质期的有效方法。此 approach减少了微生物腐败并抑制食源性病原体生长，从而 improve产品安全性。涂层的多组分 composition（脂质基质 + 有机酸 + 细菌素）反映了栅栏技术原则，各因素贡献于防腐效应。

此类生物导向的保鲜策略，与冷藏结合应用时，代表了禽肉加工中合成防腐剂的有前景替代方案。未来研究将聚焦于优化涂层 composition和应用方法，以及确认其在工业贮藏和物流条件下的有效性。