Angiopep-2功能化DAB树枝状聚合物经静脉递送显著增强脑内基因表达

本研究创新性地构建了靶向肽Angiopep-2修饰的第三代二氨基丁酸聚丙烯亚胺树枝状聚合物（DAB-Ang），通过体外和体内实验证实其能高效穿透血脑屏障（BBB），实现脑组织特异性基因递送，为神经系统疾病（如脑肿瘤、帕金森病、阿尔茨海默病）的非病毒基因治疗提供了突破性策略。

　　

摘要

基因疗法在治疗脑肿瘤、帕金森病和阿尔茨海默病等神经系统疾病方面展现出巨大潜力，但其临床应用受到血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）的严重限制。BBB通过紧密连接的特殊内皮细胞严格调控物质进出，保护中枢神经系统（CNS）的同时也阻碍了大多数治疗药物和大分子（如核酸）的脑部递送。近年来，利用受体介导的跨细胞作用突破BBB成为研究热点。其中，Angiopep-2是一种19个氨基酸的寡肽，能特异性结合在BBB上高表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（Low-density Lipoprotein Receptor-related Protein-1, LRP1），从而显著增强治疗剂跨越BBB的效率。

本研究聚焦于一种新型非病毒基因递送载体——第三代二氨基丁酸聚丙烯亚胺（Diaminobutyric Polypropylenimine, DAB）树枝状聚合物。DAB树枝状聚合物因其独特的支化结构、低多分散指数、易于生产以及表面功能基团的可控性，已成为有前景的核酸递送载体。与更高代数的树枝状聚合物相比，第三代DAB在基因转染效率和生物安全性方面表现更优。此前研究已将转铁蛋白（Transferrin）和乳铁蛋白（Lactoferrin）等靶向分子与DAB结合，证明了其脑靶向递送的潜力。然而，Angiopep-2与DAB的结合及其在脑靶向基因治疗中的应用尚未被探索。

材料与方法

Angiopep-2偶联DAB树枝状聚合物（DAB-Ang）的合成

通过两步法合成DAB-Ang。首先，使用双功能交联剂N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯（GMBS）活化DAB树枝状聚合物表面的氨基。随后，GMBS活化的DAB与经硫基化修饰的Angiopep-2肽反应，通过GMBS的马来酰亚胺基与Angiopep-2的巯基形成稳定的硫醚键，从而将靶向肽共价连接至树枝状聚合物。合成产物经透析纯化后，通过核磁共振氢谱（¹H-NMR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行表征，确认成功偶联并计算偶联比例。

DNA缩合能力评估

采用凝胶阻滞实验和PicoGreen荧光定量实验评估DAB-Ang缩合质粒DNA的能力。测试了从20:1到0.5:1（w/w）的一系列聚合物：DNA重量比。

树枝状聚合物复合物（Dendriplex）的表征

通过透射电子显微镜（TEM）观察DAB-Ang与DNA形成的复合物（Dendriplex）的形态。使用光子相关光谱（动态光散射，DLS）测量其流体动力学粒径和Zeta电位，评估其在不同复合比例下的物理稳定性。

体外细胞摄取与机制研究

使用小鼠脑微血管内皮细胞系bEnd.3进行体外研究。通过共聚焦显微镜和流式细胞术定量和定性评估细胞对荧光标记DNA（与DAB-Ang或未修饰DAB复合）的摄取效率。为探究细胞内吞机制，实验使用了多种内吞途径抑制剂进行预处理，包括：氯丙嗪（Clathrin介导的内吞抑制剂）、菲律宾菌素（Caveolae介导的内吞抑制剂）、秋水仙碱（巨胞饮作用抑制剂）、游离的Angiopep-2肽（LRP1受体竞争性抑制剂）以及多聚-L-赖氨酸（带正电荷分子摄取抑制剂）。

体内基因表达与 biodistribution 研究

在雌性BALB/c小鼠模型中进行体内实验。通过尾静脉单次注射DAB-Ang dendriplex（携带荧光素酶（Luciferase）或β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）报告基因质粒），并以未修饰DAB dendriplex和裸DNA溶液作为对照。

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  生物发光成像：在注射后不同时间点（24, 26, 28, 32小时）腹腔注射荧光素底物（D-luciferin），利用IVIS Spectrum活体成像系统监测并定位基因表达信号，确定表达峰值时间。

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  β-半乳糖苷酶活性定量：在表达峰值时间点处死小鼠，收取主要器官（脑、心、肺、脾、肝、肾）。组织匀浆后，通过荧光法定量分析各器官中β-半乳糖苷酶的活性，以评估基因表达的 biodistribution 和靶向特异性。

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  脑内基因表达分布：注射携带tdTomato（红色荧光蛋白）报告基因的DAB-Ang dendriplex。取脑组织进行冰冻切片、免疫荧光染色（使用兔抗DsRed一抗和Alexa Fluor 594标记的二抗）及DAPI核染色，最后通过荧光显微镜观察并分析tdTomato蛋白在脑内不同区域（如纹状体、皮层、脑桥等）的表达分布。

结果

DAB-Ang的成功合成与表征

¹H-NMR谱图显示了DAB、GMBS、Angiopep-2和最终产物DAB-Ang的特征峰。成功偶联的关键证据是GMBS谱图中位于7 ppm的马来酰亚胺质子峰在DAB-Ang谱图中消失，表明其巯基已参与形成硫醚键。MALDI-TOF MS分析确定DAB-Ang的分子量约为4779.25 Da，表明平均每个DAB树枝状聚合物分子上成功连接了约1个Angiopep-2肽分子。这种单一修饰有助于保留DAB表面大量的游离氨基，用于后续的DNA缩合。

高效的DNA缩合与稳定的Dendriplex形成

凝胶阻滞实验表明，当DAB-Ang与DNA的重量比≥2:1时，DNA被完全阻滞在加样孔内，无法在凝胶中迁移，表明DNA被有效缩合。PicoGreen定量实验进一步证实，在20:1, 10:1, 5:1和2:1的重量比下，DAB-Ang可立即缩合66.4%至77.7%的DNA，并在24小时内缩合度逐渐增加至85.4%至90.9%，表现出良好的稳定性。在1:1和0.5:1的低比例下，缩合效率显著下降（约25-30%）。Zeta电位测量显示，在高重量比（20:1, 10:1, 5:1）下，dendriplex表面带正电（+29 to +35 mV），而在低重量比下，由于大量游离DNA的存在，Zeta电位变为负值（-17 to -29 mV），与裸DNA相近（-36.5 mV）。粒径分析表明，DAB-Ang dendriplex的粒径在65 nm（5:1比例）至241 nm（20:1比例）之间，且多分散指数（PDI）低（<0.3），表明颗粒大小均匀。TEM成像显示DAB-Ang与DNA形成了规则的球形纳米颗粒，尺寸小于200 nm，与未修饰DAB dendriplex形态相似。

显著增强的体外细胞摄取与特定的内吞机制

共聚焦显微镜和流式细胞术结果一致表明，与未修饰的DAB dendriplex相比，DAB-Ang dendriplex在bEnd.3细胞中的摄取效率显著更高。在5:1的最佳重量比下，DAB-Ang的细胞摄取强度是未修饰DAB的约9倍，是裸DNA的约500倍。内吞机制研究表明，氯丙嗪（clathrin抑制剂）和秋水仙碱（macropinocytosis抑制剂）预处理使DAB-Ang的摄取分别降低了81%和87%，表明其摄取主要依赖于网格蛋白介导的内吞和巨胞饮作用。而菲律宾菌素（caveolae抑制剂）、游离Angiopep-2（受体竞争）和多聚-L-赖氨酸（正电荷竞争）的抑制效果较弱（约55.5%），说明LRP1受体介导的内吞和细胞膜吸附也参与其中，但不是主要途径。

高效的脑靶向基因表达与优异的特异性

活体生物发光成像显示，静脉注射DAB-Ang/luciferase dendriplex后，基因表达信号主要集中在小鼠脑部，并在注射后28小时达到峰值。在28小时时间点，DAB-Ang组的脑部信号强度显著高于未修饰DAB组和裸DNA组。β-半乳糖苷酶活性定量分析（biodistribution）精确证实了上述结果：DAB-Ang处理组在大脑中的基因表达水平最高（667 ± 38 mU/器官），分别是未修饰DAB组（354 ± 113 mU/器官）的1.8倍和裸DNA组（208 ± 65 mU/器官）的3.2倍。更重要的是，DAB-Ang展现了卓越的脑靶向特异性，其脑内的基因表达水平是其他主要器官（肾脏：202 mU，脾脏：200 mU，肝脏：139 mU，肺部：107 mU，心脏：9 mU）的至少3.3倍。与裸DNA相比，DAB-Ang还显著降低了在肺部的非特异性基因表达。脑组织切片荧光成像显示，通过DAB-Ang递送的tdTomato报告基因在多个关键脑区成功表达，包括纹状体、新皮层、缰核和脑桥，表明其能广泛递送至脑实质。

讨论

本研究成功开发并验证了Angiopep-2功能化的DAB树枝状聚合物作为一种高效、特异的脑靶向基因递送系统。DAB-Ang能有效缩合DNA，形成粒径适宜、带正电且稳定的球形纳米颗粒，这些特性有利于其穿越BBB。体外实验证实，Angiopep-2的修饰通过 primarily 网格蛋白和巨胞饮途径，极大地促进了脑内皮细胞对dendriplex的摄取。最令人瞩目的成果来自于体内实验：单次静脉注射后，DAB-Ang能优先将基因递送至大脑，实现显著高于对比组的表达水平，且脱靶效应极低。

与文献中报道的其他Angiopep-2修饰的纳米载体（如PAMAM树枝状聚合物、PEI-PLL nanoparticles、脂质体）相比，DAB-Ang在增强脑部基因表达的同时，有效地避免了在肝脏、脾脏等网状内皮系统的高富集和非特异性表达，显示出其独特的靶向优势。与DAB修饰的其他靶向配体（如乳铁蛋白）相比，DAB-Ang诱导的绝对基因表达水平更高，证明了Angiopep-2/LRP1靶向策略的有效性。

其成功可能归因于几个因素：1) DAB本身具有的“质子海绵”效应有助于内涵体逃逸，提高胞质递送效率；2) Angiopep-2对BBB上LRP1受体的高亲和力和特异性；3) 优化的纳米颗粒理化性质（尺寸、形状、电荷）共同促进了高效的BBB转运和脑内分布。

结论

本研究结果表明，Angiopep-2与DAB树枝状聚合物的偶联显著提高了基因递送系统的脑靶向能力。经静脉注射后，DAB-Ang dendriplex能高效、特异性地将基因递送至大脑，并实现高水平的表达，同时最大限度地减少了在其他器官的非特异性表达。这为开发治疗各种中枢神经系统疾病的新型非病毒基因疗法提供了一个极具前景的平台。未来的研究将集中于利用该平台递送治疗性基因（如神经营养因子、抗炎细胞因子等），并在神经系统疾病模型中验证其治疗功效。