基于生物信息学分析鉴定先兆子痫中昼夜节律相关枢纽基因及免疫浸润的机制研究

本综述通过整合多组学数据（WGCNA、limma、CIBERSORT等），首次系统鉴定CRH和LEP作为先兆子痫（PE）的新型昼夜节律相关诊断标志物，揭示其与免疫细胞浸润（如Th2细胞、M0巨噬细胞）的关联及分子亚型特征，为PE的精准诊断和免疫调节治疗提供新视角。

　　

Abstract

Objective

先兆子痫（Preeclampsia, PE）是一种严重的妊娠并发症，其分子机制尚不明确。新证据表明昼夜节律紊乱参与PE发病。本研究旨在识别PE中昼夜节律相关基因，探索其诊断价值及免疫特征。

Methods

从GEO数据库下载四个基因表达数据集（GSE75010、GSE60438、GSE186257、GSE14722）。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别与PE相关的模块。使用R语言limma包评估差异表达，clusterProfiler进行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析。采用受试者工作特征曲线（ROC）在训练集和验证集中评估诊断准确性。应用CIBERSORT和单样本基因集富集分析（ssGSEA）算法分析免疫浸润。使用ConsensusClusterPlus对PE患者进行亚型分型。通过miRTarBase、ENCODE和NetworkAnalyst构建ceRNA和转录因子（TF）调控网络。

Results

CRH和LEP被鉴定为具有强诊断价值的昼夜节律相关枢纽基因。基于其表达的分子分型揭示两种PE亚型，具有不同的免疫浸润模式和生物学功能。调控网络构建突出了潜在的上游机制。

Conclusion

本生物信息学分析为CRH和LEP作为PE潜在昼夜节律相关诊断生物标志物提供了初步证据。但由于发现源自有限GEO数据集，需谨慎解读，仍需大规模、多中心前瞻性研究测量其在不同人群血清或胎盘组织中的表达以确认临床效用。

Highlights

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  本研究鉴定两个新型昼夜节律相关基因作为先兆子痫的潜在诊断生物标志物。

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  揭示了先兆子痫患者免疫细胞浸润的显著改变和 distinct 分子亚型。

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  构建了全面的ceRNA和转录因子网络，揭示了关键先兆子痫基因的上游调控机制。

Introduction

先兆子痫（PE）是人类妊娠特有的严重多系统疾病，以妊娠20周后出现高血压和蛋白尿为特征。全球患病率约2%–8%，是导致不良母婴结局的主要因素，显著贡献早产、宫内生长受限以及母婴长期不良后果。尽管研究广泛，PE的确切病因和潜在病理机制尚未完全明了，使得早期诊断和有效治疗策略具有挑战性。当前诊断方法主要依赖临床症状，这些症状常在疾病进展晚期出现，因此需要识别新颖可靠的生物标志物用于早期预测和干预。

新证据表明， circadian rhythms（约24小时生物周期，调控多种生理功能）对维持妊娠期母婴健康至关重要。昼夜节律紊乱已被发现 contribute to 各种妊娠相关并发症，包括妊娠糖尿病和早产。鉴于PE的系统性，昼夜节律相关基因的失调可能 contribute to 其发生和进展。此外，免疫功能障碍是PE的一个 well-established 标志，母胎界面异常的母体免疫反应 contribute to 内皮功能障碍和 widespread inflammation。昼夜节律与免疫调节之间的相互作用日益被认识，生物钟影响免疫细胞功能和炎症反应。这种复杂相互作用在PE背景下可能特别相关。

尽管先前研究通过一般时钟基因将昼夜节律紊乱与PE联系起来，但 few 采用整合生物信息学方法识别新型昼夜节律相关枢纽基因作为诊断生物标志物。本研究创新性地结合WGCNA、多数据集验证、免疫浸润分析、分子分型和调控网络构建，以 uncover CRH和LEP作为潜在新型生物标志物，提供对上游机制和PE异质性的更深入见解。具体而言，我们采用系统生物信息学方法，包括WGCNA识别PE相关基因模块，差异表达分析 pinpoint 关键基因，以及广泛功能富集表征其生物学作用。此外，我们表征了PE中的免疫细胞浸润模式，并探索了 identified 关键基因与免疫细胞群之间的关系及其功能作用。最后，我们 formulated 基于 identified 枢纽基因的诊断模型，对PE患者进行分子分型，并阐明其调控网络，包括ceRNA和转录因子相互作用。我们的研究突出了PE中涉及的新机制，可能有助于制定更可靠的诊断标准和治疗方案。

Methods

Data acquisition

基因表达数据集（GSE75010、GGE60438、GSE186257和GSE14722）从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库获取。GSE75010和GGE60438合并形成训练队列，包括140个PE样本和142个正常样本。应用sva R包中的ComBat函数标准化合并数据集中的批次效应。GSE186257（26 PE, 18正常）和GSE14722（12 PE, 11正常）作为独立验证队列。从Genecards数据库获取1424个昼夜节律相关基因的全面列表。

Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA)

为识别PE相关基因模块，我们使用R包WGCNA进行WGCNA。对 top 25% 方差基因进行 hierarchical clustering。识别并移除异常样本。基于 scale-free topology model fit（R² = 0.85）选择软阈值功率（β = 6）生成共表达网络。通过 grouping 具有相似表达趋势的基因形成模块。应用 Pearson's correlation 量化每个模块与相应表型 traits 之间的关系。

Functional enrichment analysis and differential expression analysis

使用clusterProfiler包进行功能富集分析，包括基因本体（GO）和KEGG通路。使用limma R包进行正常组和PE组之间的差异基因表达分析。满足 |log₂FC| > 0.585 且 adjusted p-value < 0.05 的基因被视为显著差异表达。

Gene set variation analysis (GSVA)

为评估PE相关昼夜节律相关基因对PE的影响，我们使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）在训练集、GSE186257和GSE14722数据集中进行基因集变异分析（GSVA）。该策略提供了研究昼夜节律相关基因集在PE和正常样本之间差异富集的方法。

Identification and validation of diagnostic feature genes

通过交集昼夜节律相关基因、PE相关WGCNA模块中的基因和PE相关差异表达基因（DEGs）实现特征基因的识别。生成受试者工作特征（ROC）曲线研究这些特征基因在训练队列中的诊断准确性，并随后在独立GEO数据集中验证。使用曲线下面积（AUC）值量化生物标志物性能，并在训练和验证队列中检查特征基因在正常和PE组之间表达的 variation。

Immune infiltration analysis

使用IOBR R包中的CIBERSORT算法量化正常和PE样本中各种免疫细胞的浸润水平。生成箱线图可视化并统计比较两组间免疫浸润水平的差异。此外，使用GSVA包进行ssGSEA评估正常和PE组之间免疫相关功能和免疫细胞浸润评分的差异。

Single-gene enrichment analysis

从MSigDB下载预编译基因集c5.go.v2024.1.Hs.symbol.gmt（GO）和c2.cp.kegg_legacy.v2024.1.Hs.symbols.gmt（KEGG）。为研究每个生物标志物相关的生物学功能，使用GSEA软件对CRH和LEP individually 进行基因集富集分析（GSEA）。

Subtype analysis

为将PE患者分层为分子亚型，基于两个诊断生物标志物的表达值使用R包ConsensusClusterPlus在训练队列上进行共识聚类。通过检查共识累积分布函数（CDF）曲线和delta area图确定最佳聚类数（k = 2）。使用主成分分析（PCA）可视化聚类之间的分离。使用CIBERSORT和ssGSEA如前所述检查亚型之间的免疫浸润和功能差异。

GSEA analysis

通过基于特征基因表达模式的无监督聚类将PE患者分为两个 distinct 亚型（Cluster 1和Cluster 2）。创建输入文件，并使用GSEA软件（v4.3.3）进行通路富集分析，系统比较 identified 亚型之间生物学通路激活的差异。

Construction of ceRNA and transcription factors (TFs) regulatory networks

使用NetworkAnalyst通过ENCODE数据库系统研究特征基因的上游转录调节因子。从miRTarBase检索microRNA-靶基因相互作用以识别调控特征基因的miRNAs。随后，筛选调控这些miRNAs的lncRNAs以构建mRNA–miRNA–lncRNA ceRNA调控网络。使用Cytoscape（v3.10）进行网络可视化。

Cell culture

人滋养层细胞系HTR?8/SVneo，一种广泛用于模拟早期绒毛外滋养层细胞的永生化模型，在添加10%胎牛血清（FBS；HyClone, USA）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI?1640培养基（Gibco, USA）中培养。细胞在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中维持。为建立体外PE细胞模型，HTR?8/SVneo细胞在受控低氧室中 subjected to 低氧条件（1% O₂, 5% CO₂, 94% N₂）24小时。

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

使用RNA Easy Fast Cell Kit（TIANGEN Biotech Co., Beijing, China）按照制造商方案从HTR?8/SVneo细胞提取总RNA。对于cDNA合成，2 μg总RNA使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara, Japan）按照制造商说明进行逆转录。使用TB Green? Premix Ex Taq? II（Takara, Japan）在CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad, USA）上进行qRT-PCR。使用2^?ΔΔCt方法计算靶基因的相对表达水平。本研究中使用的引物序列列于Table 1。

Results

WGCNA identifies a PE-associated gene module

合并GSE75010和GGE60438数据集中的批次效应使用sva R包中的ComBat函数有效校正。批次校正后，对合并数据集中的样本进行聚类，并移除异常样本。对 top 25% 最可变基因进行WGCNA。选择软阈值功率β = 6，产生 scale-free topology fit R² = 0.85。高度相关的模块被合并，并在聚类树下描绘。模块-性状分析显示Black模块（n = 179基因）与PE状态具有最强正相关（r = 0.47, p < 0.001），将其指定为PE相关枢纽模块。此外，对Black模块中179个基因的功能富集分析揭示了显著 involvement in 生物学过程，如 cardiac chamber morphogenesis、transforming growth factor beta receptor superfamily signaling pathway 和 desmosome organization；细胞组分包括 Z disc、cell-substrate junction 和 contractile fiber；分子功能如 transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity 和 activin receptor binding；以及KEGG通路如 amino sugar and nucleotide sugar metabolism、circadian rhythm 和 acute myeloid leukemia。这些通路突出了在细胞信号、粘附和代谢调节中的作用，可能 contribute to PE发病机制。

Identification of diagnostic biomarkers based on circadian rhythm-related genes

1424个昼夜节律相关基因与WGCNA分析中 identified PE相关Black模块中179个基因的交集产生16个候选昼夜节律相关PE诊断基因。对这些16个基因的GO富集揭示了显著术语，如 biological process 中的 circadian regulation of gene expression、rhythmic process 和 circadian rhythm，而KEGG富集突出了通路包括 circadian rhythm。此外，这些候选基因之间的相关性分析 demonstrated 强正 inter-gene 相关性。训练集中的GSVA分析表明PE患者 compared to 对照受试者评分显著更高，这一发现在两个独立验证集中一致观察到。为 further refine PE相关基因，训练集中的差异表达分析识别了8个显著改变基因。诊断生物标志物的最终集合由2个昼夜节律相关PE DEGs组成，源自昼夜节律相关基因、WGCNA模块基因和PE差异基因的交集。

Nomogram construction and diagnostic validation

使用rms R包构建列线图，整合两个特征基因预测患者患PE的概率。校准曲线 demonstrated 预测和实际发病率之间的高度一致性，决策曲线分析（DCA）表明列线图提供净临床收益， indicating 潜在模型性能。此外，ROC曲线分析显示诊断模型的AUC约为0.738，而CRH和LEP的个体AUC分别为0.721和0.705，个体预测因子也显示高诊断准确性。使用GSE186257和GSE14722数据集独立验证模型诊断效能。GSE186257中的验证产生AUC为0.814（组合）、0.802（CRH）和0.789（LEP），而在GSE14722中，组合模型达到AUC为0.985，CRH alone 为0.972，LEP为0.956， suggesting 模型 exhibited excellent 诊断性能。为 further assess 诊断效用，我们计算了敏感性、特异性、准确性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和Cohen's Kappa在由Youden's index确定的最佳截断值处。这些指标总结于Table 2。最后，检查特征基因表达水平 revealed 在训练集和验证集中PE患者 compared to 正常样本表达显著升高。

Immune infiltration analysis

为 bridge 上一节 identified CRH和LEP的诊断 significance 与其潜在机制作用，我们研究了它们与PE中免疫浸润模式的关联。鉴于 established link between 昼夜节律紊乱和妊娠并发症中的免疫失调，我们 hypothesized 这些基因可能影响免疫微环境，contributing to PE发病机制。具体而言，我们观察到与对照相比，PE样本中M0巨噬细胞、T cells CD8和T cells regulatory的显著富集。此外，应用ssGSEA研究PE患者和正常样本之间免疫相关功能和免疫细胞浸润的差异。结果显示，与正常样本相比，PE样本中与Th2细胞、Tfh、CD8⁺ T细胞和MHC class I相关的免疫细胞以及Type I IFN Response和Type II IFN Response相关的免疫功能富集增强。最后，检查了 identified 特征基因与各种免疫细胞类型和免疫相关功能之间的相关性。结果显示CRH表达与T helper cells、DCs和Th2 cells呈正相关，而LEP与T helper cells、Th1 cells和Th2 cells相关。这些发现表明CRH和LEP可能 modulate PE中的免疫应答， potentially driven by 昼夜节律紊乱。

Single-gene enrichment analysis of CRH and LEP

基于免疫浸润分析， which highlighted CRH和LEP与特定免疫细胞类型的关联，我们进行单基因GSEA以阐明这些基因在PE中更广泛的生物学功能。进行GSEA以研究PE诊断生物标志物的潜在生物学功能。CRH的GSEA revealed 在GO术语中的显著富集，包括 mitochondrial protein containing complex、ribosome 和 ribosomal subunit，而LEP的GSEA revealed 在GO术语中的显著富集，包括 structural constituent of ribosome、oxidoreduction driven active transmembrane transporter 和 ribosomal subunit。类似地，CRH的KEGG通路富集分析 highlighted 与代谢通路的关联，如 propanoate metabolism、pyruvate metabolism 和 oxidative phosphorylation，以及LEP的KEGG通路富集分析 highlighted 与疾病相关通路如 Huntington's disease 和各种癌症通路的关联。这些发现表明CRH和LEP在基本细胞过程和代谢调节中扮演 diverse 角色，可能 contribute to PE的复杂病理生理学。CRH和LEP在代谢和免疫相关通路中的 diverse 角色表明PE表现中潜在的异质性。为探索这一点，我们接下来基于这些基因的表达对PE患者进行分子分型以识别 distinct 疾病内型和其相关免疫谱。

Molecular subtype analysis based on CRH and LEP feature genes

鉴于 preceding 分析中 identified CRH和LEP的差异免疫浸润和功能作用，我们 hypothesized 它们的表达模式可以揭示具有独特免疫和分子特征的 distinct PE亚型。这种亚型分型方法旨在扩展我们对PE异质性及其与昼夜节律失调联系的理解。基于关键免疫相关基因的表达谱的共识聚类将样本分为两个 distinct 分子亚型（Cluster 1和Cluster 2）。基于两个诊断特征基因的表达，使用ConsensusClusterPlus R包进行聚类分析识别了两个 distinct PE相关疾病亚型：Cluster 1（80样本）和Cluster 2（60样本）。PCA分析清楚区分了这两个亚型。两个特征基因在Cluster 1 related to Cluster 2中 exhibited 显著上调表达。我们使用ssGSEA研究两个PE亚型之间免疫相关功能和免疫细胞浸润的差异， revealing Cluster 1在免疫相关功能中具有 elevated APC co inhibition、Type II IFN Response，并且与Cluster 2相比具有 elevated B cells和Th2 cells。使用CIBERSORT算法计算PE患者中的免疫细胞浸润水平， suggesting Cluster 1 exhibited 与Cluster 2相比 plasma cells、T cells CD4 naive和T cells CD8的更高浸润水平。Cluster 1和Cluster 2亚组之间的差异表达分析识别了满足 |log₂ FC| > 0.585, p.adj < 0.05 的基因。对这些亚型中55个上调DEGs进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析 highlighted 术语包括 female pregnancy、multi-organism reproductive process 和 multi-multicellular organism process，而KEGG分析 indicated hormone signaling、neuroactive ligand?receptor interaction 和 cytokine?cytokine receptor interaction。最后，比较Cluster 1与Cluster 2的GSEA revealed Cluster 1富集了 adipocytokine signaling pathway、galactose metabolism、glycosphingolipid biosynthesis lacto and neolacto series 和 renal cell carcinoma，而Cluster 2富集了 beta alanine metabolism、fatty acid metabolism、pyruvate metabolism 和 RNA polymerase。具有差异免疫和通路激活的 distinct PE亚型的识别强调了调控CRH和LEP的复杂调控机制。为 further elucidate 它们的上游调控，我们接下来构建ceRNA和转录因子（TF）网络以探索这些基因在转录和转录后水平如何被 modulated。

Construction of ceRNA and TF regulatory networks

Having established CRH和LEP作为免疫失调和PE亚型的关键驱动因素，我们 sought to uncover 它们的上游调控机制。通过构建ceRNA和TF网络，我们旨在整合先前章节的分子和免疫见解，提供昼夜节律相关基因在PE中如何被调控的全面视图。为阐明涉及两个特征基因的转录后调控机制，我们首先从miRTarBase数据库检索 experimentally validated miRNA-靶相互作用。我们识别了六个 specifically target 这两个基因的miRNAs。随后，预测了与这些miRNAs相关的潜在调控lncRNAs，使得能够构建ceRNA调控网络。使用Cytoscape可视化这个mRNA–miRNA–lncRNA网络， illustrating identified 分子之间的复杂 interplay 和潜在调控轴。此外，为 further explore 转录调控，通过NetworkAnalyst利用ENCODE数据库识别靶向这些特征基因的TFs。发现几个关键TFs可能 regulate 这些基因的表达，它们的相互作用被映射并呈现。这种整合分析突出了涵盖转录和转录后水平的多层调控框架，可能 contribute to 疾病背景下的分子机制。这些调控网络提供了关于CRH和LEP的多层视角，将其转录和转录后调控与PE中观察到的免疫和亚型差异联系起来。这些见解在讨论中进一步合成以突出它们对PE发病机制和诊断的意义。

Validation of key genes in the PE by qRT-PCR

使用qRT-PCR评估特征基因CRH和LEP的相对mRNA表达水平。结果显示，与正常对照组相比，PE组中CRH和LEP的相对mRNA表达水平均显著上调。这些发现表明昼夜节律相关基因CRH和LEP表达的变化可能在PE发病机制中扮演角色。

Discussion

PE仍然是产科的主要临床挑战，全球范围内显著 contribute to 母婴发病率和死亡率，目前尚无可靠的早期预测或靶向治疗方法可用。尽管免疫失调和内皮功能障碍已被 implicated，但精确分子机制仍不明确。新证据表明昼夜节律紊乱可能通过调节免疫和炎症通路 contribute to PE发病，为其潜在生物学提供新见解。我们的研究利用大规模生物信息学分析识别和验证昼夜节律相关关键基因并描绘PE中的免疫浸润模式，提供对疾病机制和潜在诊断途径的新见解。

在本研究中，一个关键发现是识别两个昼夜节律相关基因作为PE的诊断生物标志物。鉴于对妊娠并发症中昼夜节律紊乱的新兴理解，这 particularly significant。两个基因在PE样本中与对照相比显著上调，并在多个数据集中 demonstrated 强诊断性能。CRH，一种主要由下丘脑合成的神经肽，在妊娠期间主要在胎盘中表达，它调节分娩时间和胎儿发育，失调的胎盘CRH可能 contribute to 内皮功能障碍和系统性炎症，这些是PE的标志。在我们的分析中，CRH在PE胎盘中显著上调，这一发现被最近一项研究 corroborated，该研究显示PE患者血清和胎盘组织中CRH水平与健康对照相比升高。这表明CRH作为应激激素，contributing to PE特征性的适应不良免疫应答。除了CRH，我们的分析还识别了 Leptin（LEP）作为另一个关键生物标志物。LEP，一种主要由脂肪组织分泌的脂肪因子，并在胎盘中丰富表达，在调节能量平衡、代谢和免疫功能中扮演 vital 角色，并影响母体代谢和免疫应答，其升高水平与PE发病机制相关。积累证据表明升高的母体LEP水平与PE发展之间存在强关联。Wang等人 confirmed 与健康孕妇相比，PE女性中 consistently observed 更高的循环LEP浓度， indicating 其作为早期诊断标志物的潜力。此外，已知LEP诱导氧化应激和内皮功能障碍，这两者都是PE病理生理学的核心。因此，进一步研究聚焦于CRH和LEP contribute to PE发病机制的精确分子机制， particularly 在昼夜节律紊乱背景下，无疑将 advance 我们的理解并最终改善受影响女性的结局。此外，我们的qRT-PCR结果确认了低氧HTR-8/SVneo细胞中CRH和LEP的上调，支持它们在PE相关内皮功能障碍和免疫失调中的作用， potentially driven by 昼夜节律紊乱。此外，我们通过WGCNA分析识别了179个枢纽基因，其中18个基因先前已被报道与GC相关。随后的严格过滤，包括差异表达分析和在独立队列中的验证，巩固了这两个基因的诊断潜力。在训练和验证集中观察到的高AUC值强调了它们作为生物标志物的潜力。这与最近识别用于早期PE检测的非侵入性生物标志物的努力一致，这对及时干预至关重要。

除了识别关键基因，我们的研究广泛表征了PE中的免疫微环境。免疫适应不良是PE的一个 well-established 驱动因素， characterized by 向促炎状态转变和T辅助细胞亚群失衡。我们的CIBERSORT分析 revealed 与对照相比，PE患者中 distinct 免疫细胞浸润模式，强调了 disturbed 免疫稳态。此外，ssGSEA提供了对 altered 免疫功能的更深入理解。观察到的 identified 特征基因与特定免疫细胞和功能之间的相关性表明PE中昼夜节律失调与免疫功能障碍之间的潜在机制联系。这与证明生物钟基因直接调节免疫细胞发育、功能和细胞因子产生的研究产生共鸣。例如，免疫细胞中生物钟的失调可以加剧炎症应答， potentially contributing to PE中看到的系统性炎症。

基于我们诊断特征基因的表达将PE患者分层为两个 distinct 亚型代表了另一个关键进展。复杂疾病中的亚型分类通常允许更个性化的诊断和治疗方法。特征基因在这些亚型中的差异表达， coupled with distinct 免疫细胞浸润模式和通路激活，表明PE内异质性疾病机制。这一发现支持了日益增长的认知，即PE不是单一实体而是具有变异内型的综合征。理解这些亚型可以为靶向治疗提供信息，超越“一刀切”方法。GSEA分析进一步阐明了每个亚型中活跃的差异生物学过程，为这些 distinct PE表现提供分子蓝图。

最后，为我们特征基因构建ceRNA和TF调控网络提供了其上游调控的全面视图。识别参与ceRNA网络的特定miRNAs和lncRNAs，以及上游转录因子，提供了治疗干预的潜在靶点。例如，lncRNAs已在各种生殖障碍中作为关键调节因子出现，包括PE，通过 sponging miRNAs 和 modulating 基因表达。类似地，TFs在基因表达调控和疾病发病机制中扮演 central 角色。阐明这些调控层为开发旨在 modulating 这些关键基因及其上游调节因子表达或活性的新颖治疗策略提供了有希望的途径。

此外，Chen等人最近的一项研究类似地采用生物信息学方法在重叠数据集（如GSE75010）上使用WGCNA、具有SHAP可解释性的机器学习和用于免疫分析的ssGSEA识别核糖体生物发生相关枢纽基因（如GLUL、DDX28）作为PE生物标志物。我们的设计在使用WGCNA和ssGSEA将基因与PE中免疫失调联系起来方面一致， reinforcing 改变免疫浸润（如Th2细胞）的作用。然而，我们聚焦于昼夜节律相关基因（CRH和LEP）与它们强调核糖体生物发生不同，枢纽基因无重叠。这突出了互补机制：昼夜节律紊乱可能与PE发病机制中的核糖体 stress 相交。与它们的qRT-PCR验证不同，我们的工作扩展到PE亚型分型和ceRNA/TF网络，为靶向治疗提供更广泛的调控见解。

总之，我们的研究利用多组学生物信息学方法识别和验证新颖昼夜节律相关关键基因作为PE的诊断生物标志物。我们全面表征了免疫浸润模式并识别了 distinct PE亚型。此外，我们构建了复杂调控网络，提供对PE分子基础的更深入理解。这些发现不仅增强我们对PE发病机制的理解，而且为开发改进的诊断工具和靶向治疗策略 for 这种毁灭性妊娠并发症提供基础。

尽管本研究通过整合生物信息学分析提供对昼夜节律相关基因在PE中潜在作用的新见解并识别CRH和LEP作为诊断生物标志物，但应承认几个局限性。首先，结论主要源自公开可用的转录组数据集，这些数据集样本量有限且是回顾性的， potentially introducing 选择偏倚和批次效应。其次，尽管CRH和LEP在训练和验证集中 demonstrated 稳健诊断性能（AUC值范围0.721至0.972），但缺乏大规模前瞻性临床研究限制了它们作为稳健诊断生物标志物的可靠性验证。未来多中心、大队列前瞻性研究对于评估它们在临床环境中的实际效用和预后价值至关重要。最后，本调查主要依赖生物信息学方法，通过qRT-PCR初步验证CRH和LEP差异表达；然而，它缺乏更深入的功能实验（如 knockdown/overexpression assays 或体内模型）以阐明它们在PE发病机制中的精确作用。

Conclusion

总之，我们的研究呈现了增强当前对PE发病机制理解的全面生物信息学分析。我们识别了两个昼夜节律相关基因（CRH、LEP）作为稳健诊断生物标志物，并在多个独立数据集中验证。此外，我们揭示了 distinct 免疫微环境特征和分子亚型，突出了PE的异质性。这些发现为PE的复杂病因提供宝贵见解，并为开发精确诊断和 potentially 个性化治疗策略提供基础。

Acknowledgments

不适用。

Author contributions

JT、QD和XC contribute to 研究设计。JT和QD进行文献检索。JT和XC获取数据。JT撰写文章。QD进行数据分析。XC修订文章并