亨廷顿蛋白与F-肌动蛋白复合物结构解析揭示其在细胞骨架组织中的关键作用

为解决亨廷顿蛋白（HTT）在细胞骨架中的作用机制问题，研究人员通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）和亚断层图平均（STA）技术，揭示了HTT通过N-HEAT和Bridge结构域直接结合并桥联平行F-肌动蛋白 filaments，形成约20 nm间距的束状结构。该研究不仅阐明了HTT调控轴突生长锥形态和功能的分子基础，还为亨廷顿病的病理机制提供了新视角。

　　

在神经生物学领域，亨廷顿蛋白（Huntingtin, HTT）长期以来因其与亨廷顿病（Huntington's disease, HD）的关联而备受关注。这种由HTT基因突变引起的神经退行性疾病，其特征是运动障碍、认知衰退和精神症状，目前尚无治愈方法。HTT蛋白本身是一个巨大的支架蛋白，参与多种细胞过程，包括转录、RNA剪接、内吞作用、代谢、细胞分裂和细胞内运输。以往的研究主要集中在HTT如何通过微管网络促进囊泡运输，但越来越多的证据表明，HTT也可能与另一种重要的细胞骨架成分——肌动蛋白（actin） cytoskeleton 相互作用。然而，这种相互作用的分子基础和生理意义一直不清楚。

近年来，研究发现HTT功能缺失或突变会影响肌动蛋白的行为，导致轴突生长缺陷。轴突生长锥是神经元轴突末端的特殊结构，负责引导轴突生长，其形态和功能依赖于肌动蛋白和微管的动态 interplay。在亨廷顿病模型中，轴突 shorter，生长锥结构松散，filopodia（丝状伪足）减少， exploratory microtubules（探索性微管）变长，这些缺陷提示HTT可能通过调控肌动蛋白 cytoskeleton 来影响神经元发育和功能。然而，HTT与肌动蛋白直接相互作用的证据不足，其结构机制更是未知。

为了解决这些问题，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》上发表了一项综合性研究，结合了功能实验、生物化学分析和尖端结构生物学技术，首次揭示了HTT与F-肌动蛋白（F-actin）复合物的高分辨率结构，并阐明了HTT如何组织肌动蛋白成束的机制。

研究人员运用了几项关键的技术方法：利用小鼠皮质神经元模型进行基因敲降和表型分析；通过重组蛋白表达和纯化获得全长人源HTT及其片段；采用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）和亚断层图平均（STA）解析HTT-F-actin复合物结构；使用负染透射电镜（nsTEM）和全内反射荧光（TIRF）显微镜观察肌动蛋白束形成；并通过超速离心沉降实验测定结合常数。样本来源于小鼠原代皮质神经元和COS-7细胞等细胞系。

HTT与F-肌动蛋白在轴突生长锥中关联

研究人员首先在小鼠皮质神经元中敲降HTT，发现HTT缺失导致轴突变短，生长锥面积增大，filopodia减少，actin crown perimeter（肌动蛋白冠周长）变长，exploratory microtubules变长。免疫荧光显示HTT与微管和F-肌动蛋白共定位，尤其在filopodia和肌动蛋白-微管界面富集，但不与lamellipodia（板状伪足）中的 branched actin network 结合。 detergent extraction 实验证实内源性HTT与细胞骨架结合。

HTT直接结合F-肌动蛋白并组织肌动蛋白成束

体外实验表明，全长HTT（FL-HTT）与F-肌动蛋白共沉降，但不与微管结合，计算得到的表观解离常数（K_dapp）为236 ± 148 nM。TIRF显微镜显示HTT诱导肌动蛋白成束，且浓度越高，束越粗。负染电镜显示HTT形成 cross-bridges，间距为36.5 ± 4.4 nm（相当于肌动蛋白 helix 的半 pitch），肌动蛋白 filament 间距为20.4 ± 1.9 nm，提示HTT可能二聚化。

HTT F-actin复合物的冷冻ET结构

通过cryo-ET和STA，研究人员解析了HTT与F-肌动蛋白复合物的结构，全局分辨率为10.1 ?。结构显示HTT的N-HEAT和Bridge结构域包裹在F-肌动蛋白侧面，而C-HEAT结构域被 displaced。HTT结合五个肌动蛋白亚基，直接与三个相互作用：Bridge结构域结合肌动蛋白#3和#5的 subdomains（SDs），N-HEAT结合#1和#3。与HAP40复合物结构比较表明，F-肌动蛋白和HAP40竞争结合HTT的相同位点。

HTT通过其N-HEAT和Bridge结构域与F-肌动蛋白相互作用

片段结合实验显示，包含N-HEAT和Bridge的片段（HTT_N-B）、Bridge和C-HEAT的片段（HTT_B-C）以及GST标记的Bridge（HTT_GST-B）都能与F-肌动蛋白结合，而N末端片段（NTD1）和C-HEAT（HTT_C）不能。细胞实验中，Bridge结构域 sufficient 介导与F-肌动蛋白结合。

Bridge和N-HEAT结构域中的碱性斑介导F-肌动蛋白结合

结构模型提示两个碱性簇（Basic1和Basic2）参与结合。突变实验表明，Basic2突变（Basic2mut）失去结合能力，而Basic1突变（Basic1mut）保留结合但不能成束。

HTT通过其N-HEAT结构域二聚化桥联平行肌动蛋白 filaments

二聚体结构显示两个HTT通过N-HEAT界面 dimerize，桥联平行肌动蛋白 filaments，间距约20 nm。生化实验证实HTT_N-B能成束，而HTT_B-C和Basic1mut不能。STORM超分辨成像显示FL-HTT和HTT_N-B增加肌动蛋白对象宽度。

HTT的肌动蛋白成束活性为轴突生长所必需

细胞实验中，Basic2mut失去与肌动蛋白结合，而Basic1mut保留结合但不能 rescue HTT敲降导致的轴突缺陷。表达HTT_N-B（结合和成束 domain）能 rescue 轴突缺陷，而HTT_C（不能结合）不能。多聚谷氨酰胺扩展（Q78-HTT）与野生型（Q21-HTT）在结合和成束能力上无显著差异。

讨论与结论

本研究首次提供了HTT作为肌动蛋白结合蛋白的结构和功能证据，阐明其通过二聚化桥联平行肌动蛋白 filaments，形成特定几何结构的束。这种 cross-linking 可能为生长锥 motility 提供机械支持，并影响细胞分裂、粘附和 mechanotransduction signaling。HTT与肌动蛋白的结合位点与 myosin、Arp2/3 complex 和 fascin 等蛋白竞争，提示HTT可能定义 specialized 肌动蛋白网络，如 parallel bundled filaments，与 fascin 或 plastin 介导的束（间距12-16 nm）不同。二聚体界面较小，可能允许结构可塑性。

在亨廷顿病中，野生型HTT单倍体不足可能 contribute 轴突缺陷，而非突变型HTT的 direct 干扰。此外，C-HEAT结构域的暴露可能 enable 与其他蛋白 partner 的相互作用。这些发现不仅增进了对HTT功能的理解，也为开发亨廷顿病治疗策略提供了新靶点。

总之，这项研究通过多学科方法，揭示了HTT在细胞骨架组织中的新角色，为神经发育和疾病机制提供了重要 insights，标志着该领域的重大进展。