尼帕病毒基质蛋白利用皮层肌动蛋白稳定病毒组装位点并促进出芽的机制研究

本研究揭示了尼帕病毒（NiV）基质蛋白（M）通过其羧基末端结构域与宿主F-肌动蛋白相互作用，依赖Arp2/3复合物介导的肌动蛋白分支化，稳定病毒在质膜上的组装位点并促进病毒出芽，为副黏病毒科的组装机制提供了重要见解。

　　

在病毒学研究中，副黏病毒科作为一类具有重要临床意义的病毒，其成员通过呼吸道飞沫和直接接触传播，对人类健康构成严重威胁。其中，尼帕病毒（Nipah virus, NiV）和亨德拉病毒（Hendra virus, HeV）属于亨尼帕病毒属，是人畜共患病原体，在东南亚和澳大利亚地区每年引发疫情，人类感染后的死亡率超过70%。尽管这些新发副黏病毒带来巨大威胁，目前尚未有针对人类的疫苗或治疗方法获批。

副黏病毒是具包膜、负链、不分节段的RNA病毒。其基因组编码六种蛋白，包括用于病毒入侵的两种膜糖蛋白——融合蛋白（F）和附着蛋白（H/HN/G）、基质蛋白（M）以及用于核糖核蛋白（RNP）复合物形成和RNA基因组复制的三种蛋白——核蛋白（N）、大聚合酶蛋白（L）和磷蛋白（P）。其中，M蛋白在大多数副黏病毒的组装和出芽过程中起核心作用，因此在病毒宿主细胞间传播中至关重要。

以往研究通过冷冻电子断层扫描显示，麻疹病毒（MeV）M蛋白在感染细胞和无细胞病毒颗粒的组装和出芽位点处，于质膜（plasma membrane, PM）内叶形成二维阵列，与新城疫病毒（NDV）类似。X射线晶体学研究表明，副黏病毒M形成二聚体，并通过与膜脂质、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[phosphatidylinositol 4,5-biphosphate, PI(4,5)P₂]相互作用与质膜结合。与PS和PI(4,5)P₂的结合触发M的构象和静电变化，以产生膜曲率，但此过程中宿主因子的参与尚不清楚。

肌动蛋白细胞骨架由肌动蛋白丝（F-actin）组成，这些丝可组织成能够动态重塑的高级阵列。其中，肌动蛋白皮层（actin cortex）被定义为质膜下方的肌动蛋白网络。许多细胞内病原体利用宿主皮层肌动蛋白网络来完成其生命周期。在副黏病毒中，肌动蛋白聚合抑制剂或稳定剂部分抑制麻疹病毒的生产，因为它们影响RNP向质膜的细胞内运输和病毒粒子的成熟。麻疹病毒被观察到从微绒毛样结构出芽，其中负指向的肌动蛋白丝与出芽病毒粒子紧密相关。仙台病毒（Sendai virus, SeV）和新城疫病毒（NDV）的M蛋白已被证明直接与肌动蛋白丝相互作用。此外，HIV-1通过Gag直接与F-肌动蛋白相互作用来操纵肌动蛋白细胞骨架以促进病毒生产，HIV-1 Gag粒子从CD4 T细胞释放依赖于Rac1-IRSp53-Wave2-Arp2/3信号通路。Arp2/3复合物 nucleates 分支肌动蛋白的形成，这对肌动蛋白皮层和大多数丝状伪足至关重要。呼吸道合胞病毒需要Arp2来生产感染性后代病毒粒子，并且Arp2依赖的丝状伪足形成和细胞运动促进细胞间病毒传播。Arp2/3介导的肌动蛋白分支阻止HIV-1病毒粒子在感染T细胞中的生产，部分与T细胞膜上HIV-1 Gag簇数量减少相关。尽管如此，Arp2/3和丝切蛋白（cofilin）在基于蛋白质组学的相互作用研究中被确定为NiV-M的细胞结合伙伴。

在此背景下，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》上发表论文，深入探究了NiV-M如何利用宿主肌动蛋白细胞骨架来促进病毒组装和出芽。本研究通过多种先进技术手段，包括分子生物学、细胞生物学、超分辨率显微镜和活细胞成像等，系统阐明了NiV-M与肌动蛋白相互作用的分子机制及其功能后果。

研究采用的关键技术方法主要包括：分子克隆构建NiV-M野生型及突变体质粒；病毒样颗粒（Virus-like particle, VLP）生产与纯化及Western blot分析；免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, Co-IP）验证蛋白质相互作用；免疫荧光染色与共聚焦显微镜观察；扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）观察细胞膜突起；单分子定位显微镜（Single-Molecule Localization Microscopy, SMLM）进行纳米尺度成像与分析；全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence microscopy, TIRF-M）结合单粒子追踪（Single-Particle Tracking, SPT）进行动态过程分析；以及细胞活力测定等。实验主要在PK13（猪肾上皮细胞）、COS-7（非洲绿猴肾成纤维细胞）、HEK293T（人胚胎肾上皮细胞）和HeLa（人宫颈腺癌细胞）细胞系中进行。

NiV-M通过其羧基末端结构域与宿主肌动蛋白相互作用促进VLP生产

研究人员通过蛋白质序列比对，在NiV-M的羧基末端发现了一个保守的“RILK”结构域，该结构域与SeV和hPIV1 M蛋白中的肌动蛋白结合基序高度相似。结构分析表明，该结构域位于NiV-M二聚体的外部，空间上远离膜结合和二聚化的关键基序。通过点突变（如I349A和K351A）和免疫共沉淀实验，证实I349和K351残基对于NiV-M与β-肌动蛋白的相互作用至关重要。VLP生产实验表明，这些突变体产生VLP的效率低于野生型（WT）。在COS-7细胞中，I349A突变体诱导的膜突起少于WT。此外，通过共聚焦显微镜分析，发现与WT相比，I349A和K351A突变体产生的VLP中掺入β-肌动蛋白的比例更低。这些数据表明，NiV-M与肌动蛋白的相互作用对于产生膜突起和将肌动蛋白掺入VLP至关重要，从而将肌动蛋白相互作用与病毒组装和出芽机制联系起来。

F-肌动蛋白解聚破坏NiV-M组装位点的纳米级组织

研究人员发现NiV-M与波形蛋白（vimentin）共同分配至细胞裂解物的细胞骨架部分，表明NiV-M主要与F-肌动蛋白相关。使用肌动蛋白解聚药物拉春库林A（latrunculin A, LatA）处理PK13细胞后，细胞尺寸变小，精细肌动蛋白结构减少。通过SMLM分析NiV-M的纳米级组织，发现LatA处理的细胞中，NiV-M定位形成的小簇更多，未成簇的定位点也更多，其聚类倾向（Hopkin指数）显著降低。虽然簇的密度相似，但LatA处理下的NiV-M簇尺寸更小，形状更不规则。这些结果表明宿主细胞中的F-肌动蛋白促进了NiV-M在质膜上的聚类，从而增强了NiV VLP的生产。

NiV-M组装位点的纳米级组织依赖于其与F-肌动蛋白的接近程度

通过双色SMLM对PK13细胞腹侧膜上的NiV-M和肌动蛋白细胞骨架进行成像，发现NiV-M簇分布在F-肌动蛋白周围。根据其与F-肌动蛋白的关联，将NiV-M簇分为“on”（共定位）和“off”（不共定位）两组。定量分析显示，与F-肌动蛋白关联的NiV-M簇更大、密度更高，且形状更不规则，而那些远离F-肌动蛋白的簇则主要是圆形的。这些结果表明NiV-M的纳米级聚类与其接近F-肌动蛋白的程度相关。

F-肌动蛋白将NiV-M组装位点保留在质膜上

为了区分F-肌动蛋白促进NiV-M纳米级聚类的两种可能机制（即促进招募或稳定现有位点），研究人员使用TIRF显微镜结合SPT分析，监测了GFP-NiV-M斑点的强度随时间的变化。强度曲线揭示了三个不同的阶段：快速增加的组装阶段（阶段1）、强度稳定的膜滞留阶段（阶段2）和荧光衰减的释放阶段（阶段3）。通过共表达F-肌动蛋白探针Ftractin-mCherry，观察到一些NiV-M斑点停留在F-肌动蛋白上或沿其移动（“on actin”），而另一些则横向远离F-肌动蛋白移动（“off actin”）。分析表明，“on actin”轨迹的膜滞留时间显著长于“off actin”轨迹，而两者的组装速率相似。这些数据表明，F-肌动蛋白通过维持NiV-M组装位点与质膜的关联来稳定它们，而不是促进额外的NiV-M分子招募到组装位点。

NiV-M-I349A受损的F-肌动蛋白相互作用导致分散的纳米簇和减少的膜滞留时间

进一步研究表明，肌动蛋白结合缺陷型NiV-M突变体I349A在细胞膜上形成更分散、更小的簇，其聚类倾向和成簇定位点的比例均低于WT。虽然簇的密度相似，但I349A形成的簇形状更规则。通过TIRF和SPT分析I349A斑点的强度变化，发现其组装速率与WT相当，但膜滞留时间显著减少。这些结果证实，破坏NiV-M-肌动蛋白相互作用会导致NiV-M在质膜上分布更分散，表明其在组装过程存在缺陷或现有组装位点发生分解。

Arp2/3驱动的F-肌动蛋白分支将NiV-M组装位点保留在膜上并促进VLP出芽和释放

研究人员假设Arp2/3驱动的F-肌动蛋白分支和聚合负责NiV-M组装位点的膜滞留。使用Arp2/3抑制剂CK-666处理HeLa细胞或通过siRNA敲低内源性Arp2和Arp3，均显著降低了VLP产量。在COS-7细胞中，NiV-M诱导的膜突起数量与CK-666的处理剂量呈负相关。TIRF观察发现许多由NiV-M形成的手指状结构，这些结构与SEM图像中看到的膜突起非常相似。在对照组（DMSO）中，手指状结构与斑点的数量比率随时间增加，而在CK-666处理的细胞中未观察到这种增加。SMLM图像显示NiV-M主要分布在F-肌动蛋白的一端或沿着F-肌动蛋白分布，暗示NiV-M可能参与膜突起形成过程中肌动蛋白的成核和聚合。通过TIRF和SPT分析CK-666处理的PK13细胞中NiV-M的强度曲线，发现与对照处理的细胞相比，NiV-M斑点的膜滞留时间显著减少，而组装速率未受影响。这些结果突显了Arp2/3驱动的肌动蛋白聚合和分支通过F-肌动蛋白依赖性膜滞留来促进NiV VLP生产的作用，该过程可能依赖于NiV-M与F-肌动蛋白的相互作用。

讨论与结论

本研究综合运用了时空分析技术，揭示了F-肌动蛋白通过维持NiV-M组装位点的膜滞留，而非改变组装速率，来依赖性地保证其结构完整性。结合Arp2/3促进VLP生产和NiV-M诱导膜突起生成的结果，表明：1) NiV-M组装位点在组装完成后仍保留在质膜上；2) F-肌动蛋白通过防止NiV-M解聚或从质膜解离在此滞留中起重要作用；3) NiV-M组装位点的膜滞留可能与Arp2/3驱动的F-肌动蛋白聚合和分支有关，这进一步促进了膜突起的产生。

研究人员提出了一个模型：NiV-M二聚化并与质膜上的PS和PI(4,5)P₂结合后，与F-肌动蛋白相互作用，以维持NiV-M组装位点在质膜上的纳米级组织和稳定关联，确保病毒组装位点的正确形成。同时，NiV-M利用Arp2/3驱动的F-肌动蛋白分支产生膜突起，为病毒出芽所需的膜曲率提供支持。研究发现强调了F-肌动蛋白在NiV组装和出芽中的双重作用：1) 作为支架，维持NiV-M组装位点在质膜上的空间组织和膜关联；2) 促进NiV-M诱导的膜突起和VLP出芽。

该研究为副黏病毒乃至其他包膜病毒如何利用宿主细胞骨架完成其生命周期提供了新的 mechanistic 见解，对未来开发针对病毒组装和出芽过程的干预策略具有潜在意义。然而，鉴于肌动蛋白在病毒组装和出芽中的作用可能因细胞类型、病毒株和实验系统而异，在更具生物学相关性的系统（如非感染性复制子或替代病毒）中进行进一步验证是必要的，特别是考虑到研究活尼帕病毒所需的生物安全四级（BSL-4）限制。未来的研究也需要确定这些机制在其他副黏病毒或相关包膜病毒中是否保守。