核纤层蛋白A下调通过异染色质-核周解锚定触发细胞命运转变的机制研究

本研究针对细胞命运决定中核结构与细胞外基质刚度相互作用的分子机制不明确的问题，开展了Lamin A（LMNA）调控细胞分化和命运决定的主题研究。研究人员通过基因敲除、CUT&Tag测序和基质刚度调控等技术，发现LMNA缺失可促进肌细胞和成纤维细胞向神经样命运转分化，其机制涉及Lamin B1结构域重塑、H3K9me2/3异染色质解聚和核周重分布。该研究揭示了基质刚度通过LMNA介导的表观遗传调控细胞命运的新机制，为神经组织工程和再生医学提供了新策略。

　　

在再生医学领域，科学家们一直试图破解细胞如何根据外界机械信号决定自己命运的奥秘。细胞生活的微环境——细胞外基质的软硬度，就像一张无形的"指挥网"，悄悄影响着细胞的命运选择。然而，这种机械信号是如何传递到细胞核内，又是如何通过改变基因表达来指导细胞分化的，其中的分子机制仍有许多未解之谜。

核纤层蛋白A（Lamin A，简称LMNA）作为细胞核内的"骨架蛋白"，其表达水平与组织刚度密切相关：在骨骼、肌肉等硬组织中高表达，而在大脑、肝脏等软组织中表达较低。这种奇特的表达模式暗示LMNA可能是连接外界机械信号与细胞命运决定的关键分子。但LMNA究竟通过什么机制来调控细胞命运？它是否会影响染色质的空间结构和表观遗传修饰？这些问题亟待解答。

为了回答这些问题，研究人员在《BIOMATERIALS RESEARCH》上发表了一项开创性研究。他们发现降低LMNA表达能够促使硬细胞（如肌细胞和成纤维细胞）转分化为神经样细胞，这一过程是通过异染色质从核周解离并重新分布来实现的。更令人兴奋的是，软基质（0.2 kPa）能够放大LMNA敲除细胞的神经分化能力，而视黄酸（retinoic acid，RA）则通过抑制LMNA表达来增强神经相关基因的表达。这些发现不仅揭示了基质刚度诱导的细胞命运调控新机制，还为神经细胞生成提供了全新途径。

研究人员运用了多项关键技术：通过CRISPR/Cas9系统构建LMNA基因敲除（KO）的小鼠成肌细胞（C2C12）和成纤维细胞（NIH3T3）细胞系；使用微流控装置评估细胞变形能力；采用RNA测序（RNA-seq）分析基因表达谱；通过CUT&Tag测序技术研究Lamin B1相关结构域（LADs）的变化；利用免疫荧光染色和Western blot（WB）分析蛋白表达和定位；制备不同刚度（0.2 kPa和10 kPa）的聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶模拟细胞外基质微环境；使用视黄酸（RA）处理抑制LMNA表达。

LMNA抑制增强神经相关基因表达

研究人员首先构建了C2C12细胞的LMNA敲除系，发现KO细胞核显著增大，长宽比增加，且通过微流控通道的速度更快，表明细胞变形能力增强。RNA-seq分析显示，LMNA敲除后共有1883个差异表达基因，其中640个基因上调。这些上调基因主要富集在脑组织中，而肌肉相关基因显著下调。基因本体（GO）分析表明，16%的生物学过程术语与神经发育直接相关，包括突触组装、轴突导向、神经系统发育和神经元分化。具体而言，肌源性转录因子Myog和Myf5表达显著下调，而神经相关基因Nes、Pax6、Lhx1和Six3显著上调，表明细胞命运向神经方向转变。

LMNA抑制增强细胞获得神经样命运

在成纤维细胞NIH3T3中也观察到类似现象：LMNA敲除细胞核增大，通过微流控通道更快。Western blot分析证实，在C2C12和NIH3T3的LMNA敲除细胞中，Nestin和Pax6表达均显著增加。免疫荧光染色显示，野生型细胞中几乎检测不到Pax6表达，而LMNA敲除细胞中核内Pax6表达显著增加，与神经干细胞系NE-4C的水平相当。虽然并非所有细胞都转化为Pax6阳性细胞，但阳性细胞比例显著增加。Nestin的分布也显示，在C2C12和NIH3T3的LMNA敲除细胞中平均荧光强度显著高于野生型。

敲除LMNA减小LADs大小

研究表明Lamin A/C通过LADs调控基因表达，而Lamin B1是CUT&Tag检测LADs的主要结合蛋白。分析发现LMNA敲除后，Lamin B1 CUT&Tag数据显示LADs显著减少了116-Mb。对转录单元的进一步检查显示，LMNA敲除后Lamin B1减少。基因特征注释显示，在两组C2C12野生型细胞中，启动子区域分别占LADs总区域的21.94%和23.39%，而在两组C2C12 LMNA敲除细胞中，启动子区域仅占5.37%和5.54%，表明这些启动子区域可能被释放，从而促进神经相关基因表达。同时，肌特异性转录因子Myf5和Myf6在C2C12细胞中与Lamin B1的结合增加，而神经相关基因Nes与Lamin B1的结合在LMNA敲除后减少，这种趋势与基因表达变化呈负相关。

LMNA敲除改变组蛋白甲基化修饰分布

LADs和染色质分布与表观遗传修饰复杂相关。LMNA敲除后，WB分析显示KO细胞中H3K9me2和H3K9me3的总水平没有显著变化。通过免疫荧光技术检查H3K9me3的空间分布，发现每个细胞的H3K9me3斑点数量显著增加，而斑点面积减小。进一步分析每个细胞中H3K9me3斑点的面积分布，发现LMNA敲除后斑点大小减小到小于10μm2，表明LMNA破坏导致H3K9me3斑点解聚，形成许多更小的斑点。同时，LMNA敲除细胞中Lamin B1的平均荧光强度高于野生型细胞，尽管只有部分核膜显示Lamin B1覆盖。这些发现表明，LMNA敲除后致密的异染色质区域开始溶解，促进了解锚基因的释放和转录活性。

研究人员还分析了H3K9me2、H3K27me3和H3K9ac的分布。将每个细胞从细胞一端到另一端，从核周区到核质划一条"线"并分成20等份，测量每种组蛋白修饰的平均荧光强度。分析显示，在C2C12野生型和NIH3T3野生型细胞中，H3K9me2显著富集在核周围，而在C2C12 LMNA敲除和NIH3T3 LMNA敲除细胞中，其核质分布显著增加。相反，在C2C12 LMNA敲除和NIH3T3 LMNA敲除细胞中，H3K27me3和H3K9ac的核质分布减少，WB分析显示KO细胞中H3K27me3的总水平没有显著变化。这些结果表明LMNA敲除破坏了核周染色质，导致核周异染色质区域溶解，可能促进这些区域的基因转录恢复和增强基因表达。

软基质放大LMNA-KO细胞的神经分化能力

鉴于软基质下调LMNA表达并与神经命运相关，研究人员假设基质刚度可以调节LMNA在细胞命运决定中的作用。他们将NIH3T3和LMNA-KO NIH3T3细胞培养在刚度分别为0.2 kPa（软，模拟脑组织）和10 kPa（硬，模拟肌肉组织）的纤连蛋白/明胶包被的PAA水凝胶上。定量免疫荧光分析显示，与10 kPa基质和相同机械条件下的野生型细胞相比，LMNA敲除细胞在0.2 kPa基质上表现出显著更高的Nestin表达。这些发现证实软基质刚度作为一种共刺激，增强了LMNA敲除细胞的神经分化能力。从机制上讲，这种机械放大可能是通过核变形驱动的染色质重塑发生的，如之前在LADs重组研究中观察到的那样。这种基质工程化的机械和遗传通路之间的交叉对话为基于生物材料的神经诱导提供了有前景的策略。

用RA抑制LMNA促进成纤维细胞向神经分化

为了优化临床应用，抑制LMNA表达的小分子药物显示出作为生成神经细胞治疗方法的前景。RA通过调节RA转录因子的核定位来抑制LMNA表达。用RA处理NIH3T3细胞3天和7天后，通过qPCR和WB分析LMNA和神经标志基因Nes和Pax6的表达水平。结果显示，RA处理3天和7天后，Lamin A的转录和蛋白水平均显著降低，7天后效果更明显，证明RA确实抑制LMNA表达。此外，LMNA抑制后，NIH3T3细胞中Nes和Pax6的转录水平显著升高，Nestin的蛋白水平也显著增加。形态上，NIH3T3细胞核显著增大，细胞呈现细长形状，Nestin分布显著增强，平均荧光强度显著增加，这一观察结果与LMNA敲除组特征一致。因此，RA诱导的NIH3T3细胞中LMNA抑制导致神经发育相关基因Nes和Pax6表达升高。

研究讨论部分强调，本研究旨在研究LMNA在细胞命运决定中的作用及其潜在机制。研究人员明确了低LMNA水平如何通过调节染色质重新分布和表观遗传修饰来促使细胞向神经样命运转变。研究发现包括：敲除或敲低LMNA增强细胞获得神经样命运；敲除LMNA减小LADs大小并通过组蛋白修饰将Myog基因与LADs关联；RA通过抑制LMNA表达促进成纤维细胞的神经样命运。因此，研究揭示了LMNA的新功能，证明它通过表观遗传修饰和染色质重组来调控细胞命运。

Lamin A维持核的完整性。本研究观察到C2C12和NIH3T3细胞在LMNA敲除后核面积增加，细胞伸长，细胞刚度降低，与之前研究一致。神经细胞标志基因Nes和Pax6在C2C12和NIH3T3细胞中LMNA敲除后显著增加。Nestin是神经上皮干细胞蛋白，而Pax6是调节神经干细胞增殖和分化的多功能转录因子。Lhx1也在神经发生中起作用。这些结果表明LMNA敲除细胞可能表现出类似神经干细胞的特性。因此，LMNA敲除促进C2C12和NIH3T3细胞中神经相关基因的高表达，而不表现神经元形态，这可能是因为没有使用诱导神经分化的培养基进行培养。因此，LMNA敲除对细胞命运关于神经发生的影响值得进一步研究。

Lamin A通过影响基因在LADs内的定位在调控基因表达中起关键作用。相反，异染色质通过LADs锚定在核周并对基因表达产生抑制效应。本研究结果表明，在C2C12和NIH3T3细胞中敲除LMNA不影响H3K9me3和H3K9me2的水平。这一观察结果与报道不一致，报道显示在具有Lamin A的R453W突变的C2C12成肌细胞中，H3K9me3修饰和异染色质显著减少。对此差异的可能解释是Lamin A通过其羧基末端结构域与DNA相互作用，导致突变细胞和敲除细胞的功能不同。值得注意的是，LMNA敲除后，C2C12细胞中H3K9me3斑点的数量增加而这些斑点的面积减少，表明由H3K9me3标记的异染色质区域变得不那么紧凑，从而使染色质更加开放，促进细胞向神经表型转变。支持这一发现的是，先前研究报道了在缺乏Lamin A的情况下核周异染色质向核质的损失。

研究结果还揭示，LMNA敲除后细胞中肌源性转录因子Myf5的表达减少，而上调基因主要富集在与神经功能相关的术语中。这种改变主要归因于Lamin A缺失后Lamin B1结构的改变，继而改变了LADs的结构，影响了相关基因与Lamin B1的结合亲和力。Lamin B1主要定位在核周，主要与转录失活的染色质相关。相反，Lamin A/C分布在核周区和核质中，与异染色质和常染色质相互作用。

值得注意的是，Lamin A是肉瘤细胞神经定向所必需的。因此，即使对于该分化过程，Lamin A似乎也是必要的，尽管可能需要非常低的量。为了规避完全LMNA敲除的"全或无"效应，研究人员随后采用了几种策略来降低LMNA表达。RA已被证明不仅能抑制某些细胞类型中的LMNA表达，还能增加LMNA表达。在本研究中，用RA处理NIH3T3细胞导致LMNA表达降低，与之前研究一致，核大小显著增加，Nestin表达显著上升，表明RA可以诱导NIH3T3细胞分化为神经元细胞。这一发现暗示神经元特异的miR-9可能通过抑制LMNA基因表达来维持神经分化和神经命运。

这项工作从而 bridging了材料科学和表观遗传学之间的 gap，为整合机械、化学和生物 cues以控制细胞命运转变的下一代生物材料铺平了道路。通过将细胞培养在刚度可调（0.2 kPa vs. 10 kPa）的PAA水凝胶上，研究人员证明了用ECM蛋白（纤连蛋白/明胶）功能化的PAA水凝胶提供了一个可扩展的平台，来设计机械响应微环境以实现精确的神经诱导。

总之，研究建立了一个基于材料的范式，通过核介导的机械-表观遗传调控来控制细胞命运。研究还确定了一种基于细胞刚度与Lamin A表达正相关的新颖体外诱导命运转变方法。通过抑制LMNA表达，可以实现神经细胞命运，揭示了支撑细胞命运转变的表观遗传机制。重要的是，小分子药物RA不仅能抑制LMNA表达，还能使易得细胞类型转分化为神经相关细胞。这对组织工程和再生医学具有显著意义，为治疗应用提供了潜在的种子细胞。