揭示水稻黄单胞菌T6SS-2簇的抗菌功能：环境与植物保护的新策略

本研究深入解析了水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）T6SS-2分泌系统的抗菌机制，通过基因组学、分泌组学和功能分析，系统预测并验证了新型效应蛋白（如VasX_N家族蛋白PXO_00500）及其免疫蛋白的功能。研究发现该菌株能利用T6SS-2广谱杀灭动植物病原体，且毒力因子T3SS的失活不影响其抗菌活性。最终通过番茄保护实验证明，无毒突变株可有效防治 Pseudomonas syringae 感染，为绿色农业提供了新型生物防治策略。

　　

ABSTRACT

植物病原体对全球粮食安全构成严重威胁，而化学农药的过度使用引发了重大生态问题。利用微生物竞争机制为作物保护提供了一种前景广阔的绿色技术。本研究聚焦于水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）菌株PXO99A中的VI型分泌系统（T6SS）功能。研究发现PXO99A依赖其T6SS-2簇表现出显著的抗菌活性。通过基因组、分泌组和功能分析，系统预测了T6SS相关效应蛋白，检测了五种推定效应蛋白的表达，并功能验证了VasX_N家族效应蛋白PXO_00500及其免疫蛋白PXO_RS08595的毒性。进一步研究显示，PXO99A利用T6SS-2在体外（in vitro）和植物体内（in planta）杀灭多种动植物病原体。T3SS功能的失活虽消除了菌株毒力，但对T6SS-2依赖性抗菌活性影响甚微。最终，实验证明无毒力的T3SS缺陷突变体能有效保护番茄免受 Pseudomonas syringae 共感染。这些结果共同凸显了一种有效的植物保护生物防治策略。

IMPORTANCE

化学农药的毒性、环境影响及抗性问题的日益凸显，迫切需要替代性病原体管理策略。本研究通过“变废为宝”的创新思路，将植物病原体改造为类生物防治剂。通过阐明水稻黄单胞菌的毒力和抗菌功能，证明无毒突变体能利用T6SS有效对抗多种人类和植物病原体。其在番茄植株中的保护能力进一步展现了其在可持续农业实践中的巨大潜力。

INTRODUCTION

全球粮食可持续性因人口持续增长面临严峻挑战。由害虫和植物病原体引起的植物病害严重影响农业生产力，导致全球每年作物损失10%–15%，经济损失高达数千亿美元。化学农药的广泛使用引发了严重的环境和健康问题，包括食物、土壤、水源及生态系统的污染。农药残留频繁检出于食品、水源和土壤中，对公共健康构成重大风险。许多化学农药具有致癌性、细胞毒性和致突变性，进一步加剧了安全担忧。病原体对农药抗性的增强及新化学农药研发的减少，凸显了对替代性、可持续病原体管理策略的迫切需求。

生物防治利用天然微生物管理植物病害，为化学农药提供了可行替代方案。例如，Pseudomonas mosselii 菌株923产生的伪碘霉素可抑制水稻病原体X. oryzae和Magnaporthe oryzae的生长；Streptomyces hygroscopicus分泌的雷帕霉素抑制真菌病原体Fusarium graminearum的生长；Pseudomonas putida ISOF利用IVB型分泌系统保护番茄免受Ralstonia solanacearum侵害；Acidovorax citrulli通过T6SS对多种病原体展现强杀菌活性。这些发现表明，利用细菌拮抗作用开发环境友好型抗菌剂，有望增强农业可持续性并减少对化学农药的依赖。

细菌拮抗作用通过多种蛋白质机器实现，使细菌能够占据生态位并获得竞争优势。革兰氏阴性菌中的T6SS是其中一种重要装置，可直接将效应蛋白注入邻近的原核和真核细胞。结构上，T6SS类似于倒置的T4噬菌体，由至少13种保守组分组成复合体，包括膜复合物（TssJLM）、基板（TssEFGK）以及由外鞘（VipAB或TssBC）和Hcp蛋白构成的内针状管组成的双管结构。组装始于膜复合物的形成，将T6SS锚定于细胞包膜；随后基板被招募至膜复合物，启动由VgrG三聚体和锥形PAAR蛋白组成的尖锐化刺突的组装，继而组装内Hcp管和外收缩鞘。T6SS能够在毫秒内喷射效应蛋白，具有足够力量穿透细菌和真菌的细胞包膜。该系统可递送多种效应蛋白，靶向细菌、真菌、植物和动物细胞。T6SS的多功能性使其成为多样环境中细菌竞争的有力工具。

X. oryzae是引起水稻白叶枯病的革兰氏阴性菌，该病害在东南亚和西非造成重大经济损失。黄单胞菌属采用多种分子策略增强致病性和生存能力，包括多种分泌系统及相关效应蛋白。尽管并非所有分泌系统直接参与毒力，但它们共同贡献于病原体在多样环境条件下的整体适应性和适应能力。值得注意的是，T3SS分泌靶向植物宿主的效应蛋白，调节其免疫反应，在抑制宿主防御和促进疾病进展中发挥关键作用。相比之下，T6SS在黄单胞菌属中的作用尚不明确。在X. oryzae pv. oryzicola菌株GX01中，T6SS-2簇而非T6SS-1展现抗菌活性；然而，另一项在X. oryzae pv. oryzae菌株PXO99A中的研究报道称T6SS1和T6SS2均未显示抗菌活性。

本研究旨在表征PXO99A的T6SS功能。结果揭示PXO99A中的T6SS-2对多种人类和植物病原体具有广谱抗菌活性。主要毒力因子T3SS的失活消除了PXO99A对植物的毒力，但不影响其T6SS-2抗菌功能。重要的是，T3SS缺陷的PXO99A突变体能够以T6SS-2依赖性方式在植物体内杀灭病原体。这些结果凸显了利用T6SS介导的拮抗作用进行植物保护的潜力。

RESULTS

Secretome analysis and prediction of effectors

在PXO99A基因组中，两个大簇T6SS-1和T6SS-2编码了构成T6SS膜复合物和基板的大部分蛋白。此外，这些簇还包含分泌结构组分VgrG和Hcp的基因。具体而言，T6SS-1簇编码VgrG2、VgrG3和Hcp1，而T6SS-2簇包含六个不同VgrG旁系同源物和Hcp2的基因。基于VgrG、PAAR、伴侣蛋白（DUF4123和DUF2875家族）与效应蛋白之间的已知遗传联系，预测了10个辅助簇编码效应蛋白，共鉴定出21个候选效应基因。

为检测这些预测效应蛋白的分泌，采用分泌组方法通过LC-MS/MS分析比较野生型和T6SS无效突变体Δ tssB2在实验室条件下生长至OD₆₀₀为1时的分泌蛋白。在野生型和Δ tssB2突变体中分别检测到992和946个蛋白。值得注意的是，T6SS最丰富的分泌蛋白Hcp2（PXO_02047）在野生型样品中富集了26倍。然而，大多数其他T6SS相关蛋白在测试条件下未发生显著变化，这可能是由于高水平的细胞自溶导致大量胞质蛋白（包括核糖体蛋白和代谢酶）被检测到。尽管如此，未检测到任何T6SS-1结构蛋白，但发现了大多数T6SS-2组分，表明T6SS-2而非T6SS-1处于活跃状态。同时检测到五个VgrG蛋白和五个预测效应蛋白。

T6SS-2 exhibits active and bactericidal activities

为评估X. oryzae PXO99A中T6SS的功能，以大肠杆菌（Escherichia coli）菌株MG1655为猎物进行种间竞争实验。野生型PXO99A表现出强杀菌活性，显著优于大肠杆菌；而Δ tssB2突变体的杀灭能力显著受损，tssB1突变体则保持野生型杀灭水平。这些发现表明T6SS-2在种间竞争的抗菌活性中起关键作用。

同时评估了Hcp2的表达和分泌，其分泌水平是T6SS活性的标志。使用定制多克隆抗体发现，Hcp2在T6SS-2依赖性方式下良好表达并分泌，与蛋白质组结果一致，证实T6SS-2在测试的实验条件下活跃。

PXO_00500 and PXO_RS08595 form an effector-immunity pair

在效应编码簇中，注意到一个编码重复效应蛋白对PXO_00500和PXO_00498的簇，其氨基酸序列一致性达92%。PXO_00500蛋白包含保守的VasX_N结构域（IPR046864），最初发现于霍乱弧菌（Vibrio cholerae）的T6SS抗菌/抗真核效应蛋白VasX中。其邻近基因PXO_RS08595和PXO_RS08605编码推定免疫蛋白，属于T6SS_Burk_ExIF超家族，也具有高序列相似性（100%覆盖度和68%一致性）。

鉴于PXO_00500和PXO_00498的高序列相似性，聚焦于PXO_00500的毒性。利用双精氨酸转运（Tat）信号序列在大肠杆菌周质中表达PXO_00500诱导了显著毒性，该毒性通过与PXO_RS08595或PXO_RS08605共表达显著降低，其中PXO_RS08595几乎完全中和毒性。Pull-down分析证明了PXO_00500与PXO_RS08595的直接相互作用。相反，PXO_00498的周质表达在大肠杆菌中未显示细胞毒性，尽管Western blot分析检测到其表达。先前研究表明，霍乱弧菌细胞壁靶向效应蛋白TseH对大肠杆菌无毒，但对Aeromonas dhakensis高毒， due to T6SS免疫蛋白非依赖性保护通路。为确定PXO_00498是否表现出类似宿主特异性毒性，在A. dhakensis中表达带有N端Sec信号肽的PXO_00498，诱导了显著细胞毒性，该毒性通过共表达免疫蛋白PXO_RS08605强烈抑制。这些发现表明PXO_00498和PXO_00500是毒性效应蛋白，且PXO_00498/PXO_RS08605和PXO_00500/PXO_RS08595作为效应蛋白-免疫蛋白对发挥作用。

鉴于观察到的PXO_RS08595和PXO_RS08605之间的交叉保护，构建了缺失PXO_00500、PXO_RS08595、PXO_00498和PXO_RS08605的四重敲除突变体，命名为Δ PXO_00500-PXO_RS08605。该突变体在与野生型和Δ tssB1突变体的竞争实验中显示存活率显著降低，而与Δ tssB2和Δ tssB1-B2突变体相比则不然。向Δ PXO_00500-PXO_RS08605突变体补充PXO_RS08595显著恢复了猎物细胞存活。这些发现表明PXO_00500作为T6SS效应蛋白，其分泌依赖于T6SS-2簇。

PXO_00498和PXO_00500上游基因编码结构蛋白VgrG4（PXO_00502）和伴侣蛋白PXO_00501。为确定PXO_00500的分泌是否依赖于VgrG4和PXO_00501，构建了这两个基因的缺失突变体。竞争实验显示，这两种突变体与野生型菌株相比杀灭能力显著降低。此外，Pull-down实验证实VgrG4与PXO_00500相互作用。这些结果表明VgrG4和PXO_00501是PXO_00500分泌所必需的。

T6SS-2 mediates competition against plant and animal pathogens

接下来研究了T6SS-2对多种人类和植物病原体的抗菌功效，前者因蔬菜污染而对食源性疾病具有重要意义。通过竞争实验发现，T6SS-2对人类病原体霍乱弧菌C6706、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）H-10407、弥散粘附性大肠杆菌（DAEC）2787、小鼠特异性病原体Citrobacter rodentium，以及植物病原体R. solanacearum GMI1000、P. syringae pv. tomato PtoT1和P. syringae pv. tomato DC3000均发挥显著杀菌活性。

由于T3SS对PXO99A的毒力至关重要，还测试了T3SS对T6SS-2介导杀灭功能的影响，通过删除编码输出装置的hrcU基因。使用T3SS和T6SS-2敲除突变体发现，T3SS失活突变体的杀灭能力与野生型相当，表明T6SS介导的抗菌活性不需要T3SS。

为确定T6SS是否增强PXO99A在植物中的竞争适应性，利用本氏烟（Nicotiana benthamiana）感染模型进行竞争实验。比较了野生型PXO99A与T3SS无效（Δ hrcU）和T6SS-2无效突变体在杀灭人类病原体大肠杆菌ETEC H-10407、大肠杆菌DAEC 2787和植物病原体R. solanacearum GMI1000方面的能力。植物体内竞争显示，野生型和T3SS无效突变体（Δ hrcU）均显著抑制了大肠杆菌ETEC H-10407、大肠杆菌DAEC 2787和R. solanacearum GMI1000在植物中的生长。这些结果表明PXO99A的T6SS-2在植物体内具有功能并增强其适应性。

A T3SS-inactivated X. oryzae mutant protects tomato plants from P. syringae infection

为测试T6SS和T3SS突变体对植物感染的影响，测试了PXO99A在本氏烟叶片中诱导过敏反应（HR）的能力。在本氏烟叶片背面浸润细胞悬浮液，视觉观察显示野生型和T6SS缺失突变体诱导了强HR反应；相反，T3SS失活突变体（删除hrcU基因，因此命名为PXO99A^av）未造成类似对照的损伤。

最后，测试了能否利用T6SS活跃且无毒力的PXO99A^av（Δ hrcU）进行植物保护。以P. syringae pv. tomato DC3000为病原体，番茄Ailsa Craig为植物感染模型。结果显示，喷洒MgCl₂或单独Δ hrcU的番茄未发生任何疾病；而单独喷洒DC3000的番茄发病；接种DC3000和Δ hrcU混合液的番茄植株疾病症状显著减轻，表明有效防护了感染。

DISCUSSION

病原微生物栖息于复杂动态的环境中，在同一生态位面临各种挑战，包括与其他微生物竞争营养和栖息地，以及逃避宿主免疫反应。为适应这些压力，细菌进化出专门机制和分子工具来调节与宿主及周围微生物的相互作用。本研究报道了T6SS-2在PXO99A种间竞争中的关键作用。T6SS-2高效杀灭多种动植物病原体，凸显了其作为微生物武器的多功能性和效力。此外，T6SS-2在植物体内的活跃功能表明其在PXO99A植物定殖过程中增强细菌适应性的潜力。值得注意的是，PXO99A T3SS无效突变体能保护番茄免受P. syringae pv. tomato DC3000侵害，为生物防治和绿色农业实践提供了有前景的途径。

植物病原体在其原生生态位中进化出强大的生存策略。对X. oryzae的研究传统上聚焦于其在水稻中的致病性及水稻抵抗感染的机制。然而，X. oryzae的环境适应性相对较少被了解。本研究在PXO99A中预测了21个T6SS效应蛋白，反映了可能支持X. oryzae与多种竞争者竞争的广泛库。探索这些T6SS效应蛋白将深化我们对T6SS在黄单胞菌生理和生态适应性中作用的理解。

由于T6SS依赖性杀菌活性通常需要紧密细胞-细胞接触以递送效应蛋白，生物膜或胞外基质等物理屏障在自然环境中可能阻碍这种相互作用。例如，R. solanacearum GMI1000产生丰富胞外多糖，可能阻碍与PXO99A的直接接触，从而降低其抑制效果。此外，T6SS组装和效应蛋白分泌是耗能过程，需要ATP水解用于鞘动力学，这可能在资源有限环境中限制T6SS武装菌株的适应性，降低其作为生物防治剂的功效。最后，T6SS活性受环境信号严格调控，包括群体感应信号、营养可用性和应激信号，这种调控可能导致波动田间条件下的不一致抗菌效果。尽管这些限制带来挑战，但它们也突出了生物工程优化的机会。例如，最近开发了一种细胞壁裂解效应蛋白，以接触非依赖性方式获得靶向革兰氏阳性细胞的能力，表明类似方法可用于增强T6SS有效性。

本研究的一个关键限制是无法评估无毒X. oryzae在其原生水稻生态系统中的保护作用，其中生态性能和长期耐久性最终决定其作为生物防治剂的价值。野生型Xoo对其自身T6SS效应蛋白的固有抵抗力阻碍了此类原位测试。为克服这一障碍，需要设计T6SS以递送规避自身抵抗力的异源抗菌效应蛋白。第二个限制是T6SS的保护效果依赖于宿主组织的稳定定殖，这一过程可能受宿主基因型、定殖动力学和周围微生物组的影响。未来工程化能在多样宿主环境中持久存在的菌株的努力将增强其作为生物防治剂的效用。

利用细菌竞争管理植物病原体已通过大量研究证明。传统方法通常基于筛选具有保护功能的环境菌株。例如，Bernal等人证明P. putida KT2440利用其T6SS保护本氏烟植物免受Xanthomonas campestris侵害。然而，从不同生境分离的生物防治剂的引入可能无法有效适应自然环境中病原体特异性生态位。相比之下，我们提出了一种有价值的策略，利用植物病原体自身的抗菌特性进行植物保护，以X. oryzae为模型。该方法利用病原体在其原生生态位中的适应性，可能比引入的非本地环境菌株产生更大功效。该方法与我们先前关于无毒A. citrulli用于植物保护的工作一起，例证了“变废为宝”的创新范式，将植物病原体重新用作类生物防治剂。鉴于T6SS装备的植物病原体普遍存在，此类策略提供了一种可持续方法，可释放T6SS介导抗菌功能在管理农业病害中的全部潜力。该策略可通过为这些解毒植物病原体配备设计和合成的T6SS效应蛋白进一步加强。此外，将促进生长基因模块整合到这些工程化菌株中，可使其同时担任类生物防治剂和植物生长促进剂的双重角色。这种双重功能为可持续农业提供了有前景的路径，促进植物病害管理的同时增强作物生产力。

MATERIALS AND METHODS

Strains and growth conditions

本研究使用的菌株、质粒和引物详见附录。大肠杆菌、霍乱弧菌和C. rodentium在37°C有氧条件下于LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5% NaCl）中培养。P. syringae pv. tomato DC3000和PtoT1在28°C有氧条件下于LB培养基中培养。X. oryzae在28°C于NB培养基（0.3%牛肉提取物、0.1%酵母提取物、0.5%多肽和0.5%蔗糖）中培养；R. solanacearum在28°C于LBNS培养基（1%胰蛋白胨和0.5%酵母提取物）中培养。NBN培养基（0.3%牛肉提取物、0.1%酵母提取物和0.5%多肽）或NBS培养基（0.3%牛肉提取物、0.1%酵母提取物、0.5%多肽和10%蔗糖）用于构建PXO99A基因敲除突变体。本研究使用的抗生素浓度为：卡那霉素（50 μg/mL，除PXO99A为25 μg/mL）和庆大霉素（20 μg/mL）。突变体通过同源双交换使用自杀质粒pK18mobSacB构建。所有质粒构建均通过测序验证。

Secretion assay

细菌培养物在28°C NB液体培养基中震荡培养（200 rpm）至OD₆₀₀为1.0。离心（4,500 × g，4分钟，室温）收集细菌细胞，细胞沉淀重悬于新鲜NB培养基中，28°C孵育1小时。上清液通过离心（10,000 × g，4分钟，室温）收集，此步骤重复两次。细胞沉淀重悬于2× SDS蛋白上样缓冲液中制备全细胞样品。上清分泌蛋白使用三氯乙酸（TCA）方法富集：向上清中加入TCA至终浓度20%（体积/体积），-20°C孵育30分钟。沉淀通过离心（15,000 × g，30分钟，4°C）收集，丙酮洗涤，并重悬于2× SDS蛋白上样缓冲液中。所有样品98°C煮沸10分钟，随后通过SDS-PAGE和Western blot分析。

用于分泌组分析时，通过TCA沉淀富集的蛋白经SDS-PAGE分离，从凝胶中切下，随后通过LC-MS/MS分析。

Protein abundance analysis

质谱数据和标准化蛋白丰度显示在数据集S1中。数据提供了T6SS蛋白的初步鉴定。对于MA图分析，使用Python绘制平均log强度与log2（倍数变化）的关系，以说明野生型（PXO99A）和Δ tssB2菌株之间的比较。所有比较包括三个独立生物学重复。对于火山图分析，使用Python计算log2（倍数变化）和P值，每个条件使用三个独立生物学重复。

Protein toxicity assay

携带不同质粒的细胞最初在含适当抗生素和0.2%（重量/体积）葡萄糖的LB琼脂平板上30°C过夜培养。次日，将这些细胞接种到含适当抗生素和0.2%（重量/体积）葡萄糖的新鲜LB液体培养基中，生长至OD₆₀₀为1。随后制备10倍系列稀释液，并涂布于含相应抗生素和0.1%（重量/体积）L-阿拉伯糖或0.2%（重量/体积）葡萄糖的LB琼脂平板上。每个实验至少进行两个独立重复，并展示代表性结果。

Protein pull-down assays

基因用His或FLAG标记，并克隆到pET载体中进行表达。大肠杆菌培养物在含适当抗生素的LB培养基中生长至OD₆₀₀为0.6。通过添加0.1%阿拉伯糖在30°C诱导3小时或在20°C过夜诱导蛋白表达。诱导后，细胞通过离心收获，并重悬于1 mL裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，500 mM NaCl和50 mM咪唑）中，补充蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific）。细胞裂解，不溶性碎片通过离心去除。上清与Ni-NTA磁珠（Smart Lifesciences）孵育，结合蛋白用洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，500 mM NaCl和50 mM咪唑）洗涤四次以去除非特异性结合杂质。目标蛋白使用洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0，500 mM NaCl和500 mM咪唑）洗脱，洗脱样品通过Western blot分析。

Bacterial competition assays

细菌培养物在28°C液体培养基中震荡培养（200 rpm）至OD₆₀₀为1.0。杀手与猎物细胞比例调整为10:1，等体积混合细胞。混合培养物随后在28°C共孵育特定时间：MG1655和X. oryzae为4小时，PtoT1和DC3000为2小时，GMI1000为6小时，霍乱弧菌C6706、大肠杆菌ETEC H-10407、大肠杆菌DAEC 2787和C. rodentium为3小时。共培养后，通过涂布10倍系列稀释液于含相应抗生素的培养基上测定杀手和猎物细胞的存活率。

Bacterial competition assays on N. benthamiana

细菌竞争实验在4周龄本氏烟叶片上进行。杀手和猎物细胞比例调整为10:1并等比例混合。细胞混合物使用纯针头注射器注入叶片背面并标记。接种植物在植物温室中孵育3小时（大肠杆菌ETEC H-10407和大肠杆菌DAEC 2787）和8小时（GMI1000）。孵育后，收获感染叶片，液氮研磨，重悬于液体培养基中，并10倍系列稀释以分离杀手和猎物细胞用于后续分析。

Bioinformatics analysis

X. oryzae PXO99A基因组从NCBI数据库获取（GenBank登录号NC_010717.2）。预测的T6SS大小基因簇使用HMMER和Benchling软件分析。统计分析使用GraphPad Prism版本9.5.1进行。统计显著性使用双尾Student t检验评估。

Hypersensitive response assay

X. oryzae培养物在NB培养基中28°C生长至OD₆₀₀为1。通过离心收集适量细菌培养物，弃上清。细菌沉淀重悬于10 mM MgCl₂溶液中至OD₆₀₀为0.8。4周龄本氏烟叶片使用无针注射器在背面浸润。MgCl₂溶液用作阴性对照。每日观察叶片HR变化，拍照记录。

Bacterial infection assay

突变体Δ hrcU在NB培养基中28°C培养至OD₆₀₀为1，P. syringae pv. tomato DC3000（Pst）在LB培养基中28°C培养至OD₆₀₀为1。遵循方案并进行微小修改，大体积接种物通过用10 mM MgCl₂稀释细菌培养物并添加0.04% Silwet L-77制备。实验使用4周龄番茄（Ac）植株。植株喷洒以下细菌悬浮液并维持在高湿度环境中：Δ hrcU和Pst的单菌培养物，以及Pst + Δ hrcU的混合培养物。10 mM MgCl₂用作阴性对照。无论菌种类型（单或混合），每种细菌悬浮液的终浓度调整为OD₆₀₀为0.1。接种后，植株在植物温室中培养。每日观察疾病症状并拍照。接种后11天使用0–9严重度标准评估疾病症状，其中0表示无症状；1、3、5和7表示坏死病变覆盖约25%、50%、75%和100%叶面积；9表示完全幼苗死亡。疾病指数（DI）使用公式计算：DI = ∑(A × B)/(C × D) × 100%，其中A是严重度评分（0、1、3、5、7或9），B是每次处理中对应严重度评分的叶片数量，C是该处理中评估的总叶片数，D是最高严重度评分。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究由国家自然科学基金（32030001、W2431022和W2433062）和国家重点研发计划（2020YFA0907200）资助