肽聚糖完整性调控与外膜脂质不对称的分子互作机制：维持革兰氏阴性菌细胞被膜稳态的关键

本综述系统阐述了革兰氏阴性菌细胞被膜稳态维持的分子机制，重点关注肽聚糖（PG）层与外膜（OM）之间的功能互作。研究发现，LD-转肽酶LdtJ不仅介导PG非经典交联和D-氨基酸（DAA）掺入，还通过调控 stringent response（ppGpp）和Mla脂质转运通路，在维持细胞形态和代谢平衡中发挥非酶活功能。该研究为多重耐药菌（如鲍曼不动杆菌）的感染防治提供了新的靶点视角。

　　

ABSTRACT

细菌细胞被膜是革兰氏阴性菌与环境互作的关键界面，其中外膜（OM）和肽聚糖（PG）层的协同作用对维持结构完整性和抵抗膨压至关重要。尽管这种协调对生存极为重要，但连接OM和PG稳态的分子机制仍不明确。LD-转肽酶（LDTs）是一类能够催化PG肽链交联并掺入D-氨基酸（DAA）的酶，但其生理功能尚未完全阐明。本研究表征了鲍曼不动杆菌中LDT酶LdtJ的活性，并探讨了其缺失带来的后果。LdtJ的缺失会破坏细胞形态、下调PG前体基因（如^dadA和^alr）并激活严谨反应（stringent response），包括ppGpp水平升高和^dksA上调。这些缺陷在Δ^ldtJ Δ^mla双突变体中完全被抑制，表明OM脂质转运Mla通路参与补偿性调控。RNA测序显示，Δ^ldtJ突变体中的转录变化在双突变体中被逆转，凸显了PG重塑与OM脂质不对称之间的功能互作。本研究提示LdtJ不仅通过PG修饰，还通过影响更广泛的调控和代谢网络来维持被膜完整性。

IMPORTANCE

鲍曼不动杆菌是医院获得性感染的主要病原体，且对抗生素高度耐药。其生存依赖于由肽聚糖（PG）层和外膜（OM）构成的细胞被膜的完整性。虽然LD-转肽酶传统上被认为通过非经典交联强化PG结构，但我们的发现揭示LdtJ酶在调控细胞代谢和应激反应中也发挥关键作用。缺失^ldtJ会导致显著的生长缺陷和异常细胞形态——这些表型可通过破坏OM脂质不对称转运系统Mla而完全抑制。这一遗传互作揭示了PG重塑与OM脂质稳态之间此前未被认识的关联。这些见解深化了我们对革兰氏阴性菌被膜协调机制的理解。

INTRODUCTION

革兰氏阴性菌的细胞被膜由三个独立层组成：内膜（细胞质膜）、位于周质的肽聚糖（PG）层以及外膜（OM）。PG是一种网状聚合物，能够维持细胞形状、抵抗渗透压并保护细菌免受环境胁迫。PG与OM之间的协调对于维持被膜完整性和细菌存活至关重要。PG由重复的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）-N-乙酰胞壁酸（MurNAc）双糖构成的糖链组成，并通过短肽连接。在许多革兰氏阴性菌中，这些肽通常包括L-丙氨酸、D-谷氨酸、内消旋-二氨基庚二酸（^mDAP）和两个D-丙氨酸残基，其中肽链与MurNAc共价连接。PG的生物合成和重塑需要一系列酶参与，包括用于PG聚合和交联的糖基转移酶和转肽酶，以及用于成熟、周转和降解的PG水解酶——如内肽酶、羧肽酶、酰胺酶、裂解性转糖基酶和溶菌酶。

在参与PG生物合成的酶中，青霉素结合蛋白（PBPs）起着关键作用。A类和B类PBPs具有DD-转肽酶活性（DD-TPase），可形成4-3肽交联。这些4-3交联由供体五肽部分的第四个D-丙氨酸与受体茎的第三个^mDAP形成，是最主要的交联类型，在生长期间占总PG交联的60–100%（因物种而异）。相比之下，LD-转肽酶（LDTs）通过连接相邻肽茎的第三个^mDAP残基生成LD交联（也称为3-3交联）。与PBPs不同，LDTs以四肽作为供体底物，这些四肽是由DD-羧肽酶（DD-CPases）从五肽中去除末端D-丙氨酸而产生的。虽然4-3交联在大肠杆菌指数生长期占主导地位，但LD交联在指数生长期通常占总交联的约10%，在静止期增加至16%，并在某些OM应激条件下可达30–40%。

尽管LDTs对大多数细菌的生存并非必需，但它们执行除PG交联之外的多种功能。这些功能包括将D-氨基酸（DAA）掺入PG、在脂多糖（LPS）转运缺陷期间维持细胞被膜完整性、β-内酰胺耐药、冷休克以及自溶素调控。在鲍曼不动杆菌中，LdtJ是唯一的周质LDT，表明它催化LD交联形成和DAA掺入，尤其是在静止期。先前的研究表明，缺失^ldtJ会导致生长减少和细胞形态改变。虽然野生型细胞呈球杆菌形状，但Δ^ldtJ突变体呈球状且细胞长度显著缩短，该表型可被完全互补。尽管LDTs通常与静止期功能相关，但我们先前的工作表明LdtJ也对生长期生理有贡献。然而，这些作用的分子机制仍不清楚，值得进一步研究。

革兰氏阴性菌的OM是一个不对称屏障，磷脂富集在周质内叶，而LPS/脂寡糖（LOS）存在于表面暴露的外叶。这种脂质不对称对细胞维持OM屏障功能至关重要，可保护细胞免受许多外部因子（如去污剂、抗生素或溶素）的侵害，这些因子可能破坏膜完整性或导致细胞裂解。在应激条件下，磷脂可能错误定位到外叶，破坏不对称性。为了应对这种情况，革兰氏阴性菌采用机制来恢复脂质分布并保持OM完整性。在鲍曼不动杆菌中，两个保守系统有助于维持OM不对称性：Mla（维持OM脂质不对称）通路和磷脂酶A（PldA）。Mla系统由六种蛋白组成——MlaA、MlaB、MlaC、MlaD、MlaE和MlaF——它们共同作用从OM移除错误定位的磷脂并将其转运回内膜。在大肠杆菌中，MlaA是一种OM脂蛋白，与OmpC相互作用以捕获错误定位的磷脂。随后MlaC将它们穿梭至内膜MlaFEDB复合体，其中MlaF提供ATP酶驱动的转运能量。在缺乏功能性Mla通路的情况下，磷脂在细胞表面积累，破坏膜不对称性并损害屏障完整性。因此，^mla突变体对膜破坏剂（如SDS和EDTA）表现出超敏性，这些试剂通过螯合二价阳离子和破坏脂质包装来 destabilize OM。

PG长期以来被认为是细菌细胞被膜的主要结构组分，提供机械强度并维持细胞形状。然而，最近的研究表明，富含LPS的OM也在塑造细胞形态和增强被膜完整性方面发挥关键作用，特别是在抵抗内部膨压变化方面。尽管取得了这些进展，但协调PG层和OM功能以维持稳态的分子机制仍知之甚少。

本研究表征了鲍曼不动杆菌中LdtJ的酶学功能。我们确认了其LDT和DAA掺入活性，并进一步鉴定出LD-羧肽酶活性。使用催化失活突变体LdtJ_C390S，我们证明这些酶学功能在标准条件下并非维持生长适应性或细胞形态所必需。虽然LdtJ曾被认为仅在静止期介导LD交联和DAA掺入，但我们的发现表明它也在活跃生长期间积极贡献于PG合成和细胞适应性。除PG结构重塑外，LdtJ可能影响被膜相关应激反应和代谢通路，指向其在维持细胞稳态中更广泛的调控作用——这是在鲍曼不动杆菌中首次被识别。值得注意的是，我们发现将^ldtJ缺失引入缺乏Mla通路的菌株——从而破坏OM脂质不对称——可恢复生长期缺陷，包括受损的存活率和改变的形态。这些结果强调了PG生物合成与OM稳态之间协调调控的重要性。综上所述，我们的发现揭示了PG完整性与OM脂质不对称之间的功能互作，揭示了这些系统之间的交叉对话如何支持鲍曼不动杆菌的被膜稳定性。

RESULTS

Activities of the LDT LdtJ

先前对LdtJ的研究表明，该基因产物贡献于鲍曼不动杆菌的适应性和形态。Δ^ldtJ突变体细胞呈球形，无法掺入荧光DAA，并且相对于野生型菌株存在生长缺陷。为了扩展先前的报告，我们纯化了野生型酶和催化失活版本（LdtJ_C390S），其中活性位点半胱氨酸被丝氨酸取代。纯化产生两种可溶性蛋白产物。使用α-LdtJ特异性抗血清和α-His抗体的Western印迹也显示存在两种LdtJ蛋白产物。两种切下条带的MS分析显示分子量（MW）分别为45.59和43.38 kDa。这些分子量与全长LdtJ_His8X蛋白以及一个在A21和A22之间具有切割信号序列的蛋白一致，符合双丙氨酸 motif 切割。

使用从缺乏所有LDT蛋白的大肠杆菌BW25113Δ6LDT菌株中分离的PG进行了^{in vitro}酶学测定。野生型LdtJ表现出三种不同的活性：LDT、DAA添加和低水平LD-羧肽酶活性。在缺乏LdtJ的情况下，Tetra、TetraTetra和TetraTetraTetra muropeptides是从大肠杆菌BW25113Δ6LDT的PG中释放的主要muropeptides，与先前的PG分析一致。不加D-赖氨酸的LdtJ产生独特的LD交联的TriTri(Dap)、TetraTri(Dap)、TetraTriTri(Dap)和TetraTetraTri(Dap)，表明LdtJ介导的LD-LD交联。此外，我们检测到muropeptides Tri和TetraTri，与低水平LD-羧肽酶活性一致，该活性从四肽中去除末端D-丙氨酸以生成三肽。值得注意的是，TriTri(Dap)的检测进一步支持了LdtJ的双重LD-羧肽酶和LDT活性，因为该物种的形成需要LD交联形成TetraTri(Dap)并将其四肽修剪为三肽。加入D-赖氨酸后，观察到对应于Tetra-D-Lys和TetraTetra-D-Lys（D-Lys取代第4位的D-Ala）的新峰，表明LdtJ可以将DAA掺入PG。然而，在存在NaCl的情况下，这些含D-Lys的muropeptides的丰度显著降低，表明升高的离子强度干扰了LdtJ介导的DAA掺入。盐已知通过改变静电相互作用来调节蛋白质构象和活性。在高盐条件下，仅检测到LD交联的TetraTri(Dap)和TetraTetraTri(Dap)，进一步表明D-Lys掺入被选择性损害。相比之下，LdtJ_C390S对PG没有检测到活性。总之，这些发现表明LdtJ具有LDT活性和低水平LD-羧肽酶活性，以及介导D-赖氨酸（DAA）掺入PG的能力。

Loss of LdtJ enzymatic activity has no impact on the fitness and morphology of A. baumannii during the growth phase

LDT LdtJ在其信号肽之后编码四个不同的结构域：一个N端区域（残基1–146）、一个PG结合域（147–192）、一个内部连接区（193–282）以及一个YkuD LDT域（283–410），其中包括位于390位的活性位点半胱氨酸。为了研究每个结构域对LdtJ稳定性的贡献，我们生成了一系列表达缺失单个结构域的LdtJ变体的互补构建体。Western印迹分析显示，缺失N端区域（LdtJ_Δ40–146）、PG结合域（LdtJ_Δ147–192）和内部区域（LdtJ_Δ193–282）会导致蛋白质不稳定。相比之下，YkuD结构域缺失（LdtJ_Δ283–390/LdtJ_ΔYkuD）尽管移除了催化位点，但产生了稳定的蛋白质，尽管水平相对于野生型LdtJ降低。然而，表达水平与用于互补测定的野生型LdtJ和催化失活突变体LdtJ_C390S观察到的相似。

基于先前报道的Δ^ldtJ突变体中的生长缺陷，我们假设活性位点突变体LdtJ_C390S和LdtJ_ΔYkuD会损害生长期间的细菌适应性。与先前的发现一致，我们的分析揭示了Δ^ldtJ与野生型相比存在显著的适应性缺陷，该缺陷通过互补表达LdtJ等位基因完全恢复到野生型水平。出乎意料的是，用LdtJ_C390S或LdtJ_ΔYkuD互补完全将适应性恢复到野生型水平，表明LdtJ的LDT、LD-羧肽酶和DAA掺入活性在这些条件下并非维持细菌适应性所必需。

除适应性缺陷外，Δ^ldtJ菌株表现出改变的细胞形态。与先前的发现一致，野生型细胞呈现球杆菌形状，而Δ^ldtJ显得更球状。形态缺陷通过用野生型^ldtJ等位基因以及LdtJ_C390S和LdtJ_ΔYkuD变体互补而得到挽救。定量分析证实，Δ^ldtJ细胞具有显著减少的细胞尺寸，包括更短的长度、更窄的宽度和更小的表面积 compared to the wild-type cells。野生型表型在互补表达野生型LdtJ和LdtJ_C390S等位基因后完全恢复。当表达LdtJ_ΔYkuD变体时，表型部分恢复。正如预期，用LdtJ_C390S和LdtJ_ΔYkuD互补的菌株中NADA（一种荧光DAA）的荧光强度未恢复。

这些结果表明LdtJ对维持细菌适应性和正确细胞形态至关重要。尽管包含活性位点的YkuD结构域是LdtJ酶学活性所必需的，但其失活并不损害蛋白质稳定性、细菌适应性或细胞形状。这表明LdtJ通过独立于其催化活性的机制贡献于这些细胞功能。

Disruption of the maintenance of the lipid asymmetry (Mla) pathway compensates for the growth and morphological defects observed in the ΔldtJ mutant

鉴于Δ^ldtJ突变体在指数生长期的严重生长缺陷，我们试图鉴定可以恢复该表型的遗传抑制子。为此，我们分析了一个先前发表的转座子突变数据集，比较Δ^ldtJ和野生型菌株。该分析显示Mla通路所有基因中的转座子插入富集，其中四个基因在Δ^ldtJ背景中显示插入频率 statistically significant 增加。我们进一步比较了野生型和Δ^ldtJ背景中^mlaA::Tn和^mlaE::Tn的特定转座子插入。这些发现使我们假设Mla通路的破坏抑制了与Δ^ldtJ突变体相关的生长缺陷。

为了检验这一假设，我们在两个Δ^mla背景中构建了Δ^ldtJ突变体。Δ^ldtJ Δ^mlaA和Δ^ldtJ Δ^mlaE菌株都将生长适应性恢复到与野生型相当的水平。此外，在Δ^ldtJ Δ^mlaA突变体中用MlaA互补将生长表型恢复回Δ^ldtJ单突变体，证实生长缺陷的抑制依赖于Mla通路的破坏。

有趣的是，SDS/EDTA敏感性测定显示独立Δ^ldtJ Δ^mlaA重复之间存在变异性。一个源自SDS/EDTA抗性Δ^mlaA1亲本的重复保持抗性，而另一个源自SDS/EDTA敏感Δ^mlaA2亲本的重复保持敏感性。尽管OM敏感性存在这些差异，但两个Δ^ldtJ Δ^mlaA菌株都成功恢复了在Δ^ldtJ突变体中观察到的生长缺陷。此外，在SDS/EDTA敏感Δ^ldtJ Δ^mlaA2菌株中用MlaA互补将表型恢复为Δ^ldtJ单突变体。这些发现表明Δ^ldtJ适应性的恢复独立于OM完整性，而是可能源于脂质不对称的破坏。对野生型、SDS/EDTA抗性Δ^mlaA1和SDS/EDTA敏感Δ^mlaA2进行了全基因组测序。SDS/EDTA敏感菌株在一个编码SAM依赖性甲基转移酶的基因中有一个突变[S72* (TCA→TAA)]。抗性分离株与野生型相比不携带任何核苷酸变体。鉴于干净的遗传背景，我们选择抗性分离株进行进一步分析——此后称为Δ^ldtJ Δ^mla。

除Mla通路外，转座子突变也揭示了^pldA中的高频率转座子插入，该基因编码一种参与维持OM脂质不对称的磷脂酶。为了确定^pldA破坏是否类似地抑制Δ^ldtJ生长缺陷，我们在Δ^pldA背景中生成了Δ^ldtJ Δ^pldA双突变体。该菌株将生长适应性完全恢复到野生型水平。此外，Δ^ldtJ Δ^mla Δ^pldA三突变体也挽救了Δ^ldtJ生长缺陷，进一步支持了OM不对称与Δ^ldtJ表型抑制之间的联系。

除恢复生长外，在Δ^ldtJ Δ^mla突变体中Mla的失活也纠正了细胞存活率和形态的缺陷。双突变体表现出野生型细胞长度、平均宽度和表面积，完全挽救了在Δ^ldtJ细胞中观察到的球形形态。总之，这些发现支持了OM脂质不对称的破坏——而非膜完整性的普遍缺陷——补偿了由LDT LdtJ缺失引起的适应性、存活率和形态缺陷。

Transcriptomic profiling reveals compensatory gene expression changes in ?ldtJ and ?ldtJ?mla mutants during growth

为了研究Mla通路破坏如何恢复Δ^ldtJ突变体中的生长适应性、存活率和形态，我们在对数生长期进行了转录组分析。从野生型、Δ^ldtJ和Δ^ldtJ Δ^mla菌株中分离RNA，并比较基因表达谱。使用≥2倍用于上调或≤?2倍用于下调的 fold change 阈值以及双尾^t-test（^P值 < 0.05）进行差异表达分析。比较野生型与Δ^ldtJ以及Δ^ldtJ与Δ^ldtJ Δ^mla的火山图揭示了这两种比较之间相似的差异基因表达模式。相比之下，野生型与Δ^ldtJ Δ^mla的比较显示更少的基因满足差异表达标准，表明Mla破坏部分将转录组谱恢复向野生型状态。

与野生型相比，Δ^ldtJ突变体表现出 substantial 转录组变化，440个基因下调和444个上调。在Δ^ldtJ与Δ^ldtJ Δ^mla中，505个基因下调和460个上调，表明基因表达 similarly broad shift。相比之下，Δ^ldtJ Δ^mla菌株相对于野生型仅显示25个基因下调和43个上调。这些结果表明Δ^ldtJ Δ^mla的转录组谱与野生型 closely resembles，与我们的表型分析一致，即Mla破坏补偿了LdtJ的缺失。

值得注意的是，在Δ^ldtJ相对于野生型下调的440个基因中，有363个在Δ^ldtJ Δ^mla相对于Δ^ldtJ中上调。这些基因在与氨基酸代谢、脂肪酸降解和生物膜形成相关的通路中富集。相反，在Δ^ldtJ中上调的444个基因中，有387个在Δ^ldtJ Δ^mla中下调，包括参与营养转运和代谢、脂肪酸生物合成、应激反应、果糖代谢和细菌分泌系统的基因。这些 reciprocal 表达模式表明Mla破坏重新平衡了由LdtJ缺失破坏的关键代谢和应激反应通路。

在野生型与Δ^ldtJ和Δ^ldtJ与Δ^ldtJ Δ^mla之间观察到的 inverse 基因表达模式表明涉及全局调控机制。这些发现表明^ldtJ的缺失激活了补偿性转录程序，这些程序 further modulated by Mla通路的破坏。这种分层调控反应可能 underlie Δ^ldtJ Δ^mla突变体中适应性、存活率和形态的恢复。

Metabolic and regulatory disruptions in ?ldtJ are mitigated by loss of Mla function during exponential growth

为了验证RNA测序（RNA-seq）结果，我们对来自野生型、Δ^ldtJ和Δ^ldtJ Δ^mla菌株的DNase处理RNA样本进行了逆转录酶定量PCR（RT-qPCR）。合成了互补DNA（cDNA）并使用靶向在RNA-seq数据集中被鉴定为差异表达的转录本的基因特异性引物进行扩增。我们选择了^dadA、^alr和^argO进行验证，基于它们的显著表达变化和功能相关性——^dadA和^alr与D-丙氨酸代谢和PG合成相关，而^argO编码一种精氨酸输出蛋白，参与维持细胞内精氨酸稳态和调节细胞应激反应。在Δ^ldtJ突变体中，^dadA（^A1S_0095）和^alr（^A1S_0096）相对于野生型显著下调，fold change分别为41.0和26.9。相反，^argO（^A1S_1046）显著上调32.9倍。有趣的是，在Δ^ldtJ与Δ^ldtJ Δ^mla的比较中，观察到 inverse 表达模式：^dadA和^alr分别上调45.1和39.6倍，而^argO表达相对于Δ^ldtJ突变体减少31.9倍。这些RT-qPCR结果证实了RNA-seq数据，确认了在Δ^ldtJ突变体中^dadA和^alr的显著下调和^argO的上调 compared to wild type。在野生型与Δ^ldtJ Δ^mla的比较中，^dadA、^alr和^argO的 fold change 低于差异表达阈值，表明表达水平与野生型背景相当。这些发现与RT-qPCR结果一致，进一步支持了Mla破坏将基因表达恢复向野生型状态的结论。

除转录验证外，通过检查^dksA（^A1S_0248）的表达获得了RNA-seq结果的表型确认，该基因编码一种参与细菌严谨反应（stringent response）的转录调控因子。发现^dksA表达在Δ^ldtJ突变体中上调2.8倍，在Δ^ldtJ Δ^mla中下调3.1倍。^dksA调节RNA聚合酶活性，并与 alarmone (p)ppGpp——主要是鸟苷-5′, 3′-四磷酸，ppGpp——协同作用，调控应激反应基因的转录，包括在营养限制条件下参与PG重塑的基因。虽然DksA不直接结合ppGpp，但它对于介导其对转录重编程的影响至关重要。

为了研究^dksA表达与严谨反应之间的功能联系，我们使用放射性标记磷酸盐（³²P） followed by 薄层色谱（TLC）量化了细胞内严谨反应核苷酸水平。TLC分析揭示了在Δ^ldtJ突变体中ppGpp的积累升高 compared to both wild-type and Δ^ldtJ Δ^mla。TLC斑点强度的量化证实了这一观察，表明在Δ^ldt