铁转运系统在肠外致病性大肠杆菌镓耐受性中的拮抗作用机制及其治疗潜力

本研究揭示了肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）中铁载体肠菌素（enterobactin）和柠檬酸铁（ferric dicitrate）转运系统在镓（Ga3+）耐受性中的相反作用：肠菌素促进镓摄取加剧毒性，而FecA系统选择性运输铁增强抵抗。该发现为针对细菌铁代谢途径开发新型镓基抗菌疗法（如靶向FecA和锰补充策略）提供了关键理论基础。

　　

ABSTRACT

镓作为一种有前景的抗菌候选物，通过置换细菌细胞内的铁原子但不发生氧化还原循环来抑制生长，破坏必需的铁依赖过程。然而，大肠杆菌对镓的自然敏感性低于许多其他细菌，其耐受机制尚不完全清楚。本研究采用全基因组转座子测序（TnSeq）筛选，鉴定出在硝酸镓环境中对肠外致病性大肠杆菌分离株M12存活至关重要的基因。

INTRODUCTION

肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）菌株是人类和动物许多疾病的病原体，包括尿路感染、脑膜炎、肺炎和败血症。ExPEC还感染哺乳期哺乳动物的乳腺，如奶牛常患乳腺炎， drastically 降低产奶量并造成重大经济损失。大肠杆菌占严重急性乳腺炎病例的50%–60%，这些病例常进展为败血症和死亡。多个毒力因子与乳腺感染有关，如通过病原体相关分子模式激活炎症、补体抵抗、以及乳腺上皮细胞的粘附和侵袭。通过柠檬酸铁系统获取铁是乳腺炎的关键毒力决定因子。

livestock中大肠杆菌感染常用抗生素治疗，这施加了选择压力促进耐药性。即食动物产品经常被对多种抗生素（特别是β-内酰胺类）耐药的大肠杆菌菌株污染。此外，一些从肉类中分离出的大肠杆菌菌株也对碳青霉烯类和粘菌素等最后手段抗生素显示出耐药性。耐药大肠杆菌菌株也常见于生乳中。大肠杆菌中日益增长的抗菌素耐药性是影响人类和动物健康的紧迫全球挑战。

抗菌金属几个世纪以来一直被用于防止细菌生长，可能是减少抗生素使用的一种选择。镓治疗细菌疾病的潜力日益受到关注。镓离子和铁离子具有相似的核半径、配位化学、电离势、电负性和形成离子键的倾向。在用镓处理的细菌中，关键的含铁蛋白质可能会受损，因为Ga³⁺在生理条件下不能被还原，而Fe³⁺可以。镓化合物包括硝酸镓、麦芽酚镓、柠檬酸镓和镓-原卟啉IX在疾病的动物模型中对强大的抗生素耐药病原体有效。镓化合物可以作为一体健康方法的一部分进行探索，以预防食源性疾病或治疗受感染的动物。

尽管镓化合物在体外和体内具有抗菌活性，但许多肠杆菌科对镓表现出内在耐药性。大肠杆菌镓耐药性的潜在遗传决定因素仍然知之甚少。先前的研究已经确定了在有限数量的大肠杆菌菌株中影响镓耐药性的基因，包括实验进化实验、遗传筛选和基因表达分析。这些研究共同表明，涉及铁转运系统以及氧化应激反应的基因与镓敏感性有关。然而，关于报告为重要的特定基因或途径的重叠很少，并且它们可能不能反映属于不同系统发育群的多样化临床分离株。大肠杆菌菌株拥有大量系统来维持细胞内铁稳态，例如柠檬酸铁转运系统（Fec）、铁载体包括肠菌素、耶尔森菌素和 aerobactin，以及亚铁转运蛋白 EfeUOB 或 SitABCD。单个菌株拥有这些系统的不同组合，并且可能以不同方式表达它们，这可能会影响它们在镓胁迫下存活的相对重要性。

我们之前表明，牛乳腺炎临床分离株M12在小鼠乳腺感染中的大量生长依赖于柠檬酸铁转运系统。该菌株在 ascending 尿路感染和败血症疾病模型中也具有毒力。M12还拥有肠菌素、耶尔森菌素和 SitABCD/EfeUOB 转运蛋白的基因。在本研究中，我们使用转座子测序（TnSeq）来鉴定在镓暴露期间影响作为具有人畜共患潜力的 ExPEC 菌株示例的 M12 菌株适应性的基因。

RESULTS

Identification of genes that control gallium sensitivity in strain M12

缺乏关于 ExPEC 菌株在硝酸镓中存活所需基因的信息。在初步实验中，我们在补充了浓度范围从 1.56 μM 到 1,000 μM 的硝酸镓的 Davis 肉汤中培养 M12 菌株（序列类型 69，系统发育群 D），发现 800 μM 略有抑制但仍允许生长。为了鉴定影响 M12 菌株在硝酸镓中适应性的基因，我们采用了 TnSeq 方法。从一个包含 ～400,000 个独特 Tn5 转座子插入突变体的文库开始，我们将来自转座子突变体文库的 10 个群体汇集起来，并在有或没有 800 μM 硝酸镓的 Davis 肉汤中培养重复培养物。 overnight 培养后，从两种条件下并行收集并测序突变体群体。

然后将输出文库映射到 M12 基因组并使用 DESeq2 进行比较。中断导致适应性变化大于 2 且 P 值等于或低于 0.05 的基因列于表中。TnSeq 分析表明在硝酸镓中降低适应性的基因包括肠菌素输出蛋白 (entS)、肠菌素酯酶 (fes)、铁肠菌素周质 (fepB) 和内膜 (fepD) 转运蛋白。编码一种预测的涉及 16S 核糖体 RNA 的 RNA 解旋酶的 ybeZ 基因也基于 TnSeq 结果对适应性有害。我们选择 entS、fepD 和 ybeZ 进行进一步研究，并为每个基因创建了无标记缺失突变体。正如 TnSeq 数据所预测的，中断 M12 中的 entS 和 fepD 基因导致在镓中的生长比野生型菌株更好。相反，ybeZ 缺失并未导致在镓中生长的统计学显著差异。

TnSeq 预测会增强镓抗性的基因包括那些在抵抗抗菌胁迫中具有明确作用的基因，包括外排基因 mdlA 和 acrA、包膜胁迫转录调节因子 cpxR 和细胞壁羧肽酶 dacA。转座子测序表明，核糖体组装蛋白 ybeX（与 ybeZ 在同一操纵子中编码）以及 csgD 转录调节基因是镓抗性所必需的。值得注意的是，柠檬酸铁转运蛋白 fecA 以及编码该系统 ATPase 的 fecE 基因也在 TnSeq 筛选中被识别。我们选择创建缺失 csgD、ybeX 和 fecA 的突变体进行进一步研究。与野生型菌株相比，缺失 csgD 并未减少在镓中的生长。中断 ybeX 证明对 M12 在镓中的生长略有不利。当 fecA 被删除时，看到了更明显的缺陷。用编码 fecABCDE 操纵子的质粒 (pMO2) 互补的 fecA 突变体恢复了野生型水平的生长。在硝酸镓浓度范围从 0 μM 到 1,000 μM 的情况下测量了野生型、ΔfecA 突变体和互补菌株的生长。M12 ΔfecA 突变体在 200 μM 硝酸镓下生长与野生型菌株一样好。

为了确定 fecA 是否是其他乳腺炎相关菌株在镓存在下生长所必需的，我们从另外三个临床分离株（M34、M44 和 M66）中删除了 fecA，并将它们暴露于 800 μM 硝酸镓中。在每个菌株中，缺乏 fecA 的菌株在镓存在下观察到明显的生长缺陷，证实了它在多个乳腺炎菌株中的重要性。然而，很明显 M12 ΔfecA 比 M34、M44 和 M66 ΔfecA 突变体更敏感。此外，野生型 M44 和 M66 菌株不受 800 μM 硝酸镓的抑制。我们还观察到 M34、M44 和 M66 菌株的 fecA 突变体在无镓的 Davis 肉汤中存在轻微的生长缺陷。并非所有乳腺炎相关的大肠杆菌菌株都含有 fecABCDE 操纵子，因此可能比那些含有的菌株对硝酸镓更敏感。菌株 M3 缺乏 fecA，它在 500 μM 时有生长缺陷，但引入编码 fecABCDE 操纵子的质粒 pMO2 显著增强了在硝酸镓中的生长。

Supplementation with iron or manganese overcomes the growth defect of the fecA mutant

M12 ΔfecA 突变体在镓中适应性较差可能是因为它无法获取足够的铁来竞争培养基中的镓。为了测试这一点，我们测量了在补充了硫酸亚铁、三氯化铁和硫酸锰的 Davis 肉汤中，野生型和突变菌株在 800 μM 镓存在下的细菌生长。硫酸亚铁在 6.25 μM 时完全挽救了 M12 ΔfecA 的生长，而需要 50 μM 三氯化铁来挽救生长。与培养基中的镓（6.25 μM vs 800 μM）相比，恢复 ΔfecA 突变体生长所需的补充铁量相对较少，这表明铁比镓更容易被摄取，或者镓在关键酶的金属结合位点上竞争能力较差。有趣的是，锰比亚铁更有效，因为仅需 1.56 μM 即可恢复生长。

Loss of FecA reduces intracellular iron and increases manganese uptake in the presence of gallium

为了了解 fecA 的缺失如何影响镓胁迫下的金属稳态，我们使用电感耦合等离子体质谱法 (ICP-MS) 量化了野生型和突变菌株中铁、锌、镓和锰的细胞内积累。在野生型菌株中，培养基中存在 200 μM 镓导致细胞内铁、锰和锌略少，尽管这种差异仅对锌具有统计学显著性。相反，当在镓中生长时，M12 ΔfecA 突变体的铁含量减少到大约野生型 M12 的一半。在无镓情况下，M12 野生型和 ΔfecA 突变体观察到等效的铁水平。相反，在镓存在下生长的 M12 ΔfecA 突变体中的细胞内镓水平略高于野生型菌株，证明 FecA 不是镓进入的主要途径。在镓中生长强烈提高了 ΔfecA 突变体中的锰水平，与野生型菌株相比。当培养基中存在镓时，野生型和 ΔfecA 中的细胞内锌显著降低，ΔfecA 突变体中的锌甚至低于野生型菌株。

fecA expression is induced by gallium

当细胞内铁水平低且环境中存在柠檬酸铁时，fecA 的表达是活跃的。我们想确定镓是否会通过与柠檬酸盐复合来诱导信号传导从而影响 fecA 表达。我们创建了一个转录报告基因，其中 lacZ 基因置于先前定义的 fecA 启动子的控制之下。没有 fecA 启动子的相同质粒用作对照。如图所示，来自 fecA::lacZ 质粒的 β-半乳糖苷酶活性通过向生长培养基中添加镓而以剂量响应方式增加，这与空载体或未转化的亲本 M12 菌株不同。相反，fecA 启动子在 M12 ΔfecA 突变体中未被 200 μM 镓激活，表明 FecA 是镓柠檬酸盐信号传导所必需的。

Loss of FecA also increases sensitivity to cobalt

为了确定 M12 ΔfecA 突变体是否也对其他抗菌金属更敏感，我们测量了菌株 M12 和 M34 及其各自的 ΔfecA 突变体对硝酸银、硫酸铜和氯化钴的 MIC。硝酸银和硫酸铜的 MIC 对于野生型和 ΔfecA 突变菌株是相同的。然而，突变体在 M12 和 M34 背景下对氯化钴的 MIC 显示出两倍降低，表明柠檬酸铁导入有助于抵抗由钴以及镓诱导的胁迫。

DISCUSSION

镓的模拟铁特性使其对许多细菌有毒。然而，大肠杆菌表现出天然抗性。因此，这项工作旨在了解乳腺炎相关大肠杆菌所拥有的限制镓摄取或减轻其毒性作用的基因。我们鉴定出几个基因，特别是那些参与铁获取的基因，它们显著影响了 M12 在镓中的适应性。肠菌素铁载体基因（如 entS 和 fepD）中的转座子插入使 M12 能够在镓中存活。相反，柠檬酸铁受体基因 fecA 中的插入导致对镓的敏感性增加，表明该基因具有保护作用。这一令人惊讶的结果通过肠菌素分泌 (entS) 和受体基因 (fepD) 的缺失突变体以及多个菌株中的柠檬酸铁受体 (fecA) 的缺失突变体得到了验证。对这些发现最直接的解释是肠菌素结合镓，并且镓-肠菌素复合物被导入。因此，消除肠菌素受体或转运基因阻止了镓进入，并且消除肠菌素输出蛋白尤其具有保护作用，因为它将铁载体集中在细胞质中，在那里它可以中和细胞内的镓。相反，尽管柠檬酸盐与铁或镓复合，我们提出柠檬酸铁受体 FecA 仅运输铁。镓柠檬酸盐可以诱导信号传导导致 fecA 表达。然而，FecA 和/或周质/内膜组分 (FecB, FecC, FecD) 对铁导入具有选择性。因此，删除这些基因会减少细胞内铁，而这些铁是 necessary 与通过其他方式（如肠菌素途径）进入的更丰富的镓竞争。

据我们所知，先前没有研究报道过大肠杆菌铁转运系统在镓敏感性背景下的这种相反作用。在一项适应性进化研究中，其中大肠杆菌在选择压力下对镓产生耐药性，Graves 等人 在镓抗性群体中鉴定了 fepD 和 entS 基因间区的多态性。这些基因间 SNPs 对肠菌素基因表达或镓抗性的影响尚未确定。我们已经表明，肠菌素途径中的突变增加了镓抗性，但我们没有检测到耶尔森菌素的作用，耶尔森菌素也由 M12 菌株产生。铜绿假单胞菌的 pyoverdine 或 pyochelin 铁载体突变体也对镓更具抗性。因此，铁载体介导的镓摄取在革兰氏阴性菌中似乎很常见。

Graves 等人还注意到在镓抗性大肠杆菌群体中选择了 fecA 中的两个多态性，但他们没有验证这些变化对镓抗性的影响。两个突变都影响 FecA 的柠檬酸盐结合口袋。第一个突变导致甘氨酸变为丝氨酸，位于 400 位，紧邻柠檬酸盐结合位点。丝氨酸的极性侧链可能阻碍柠檬酸铁结合，但这尚未经过测试。值得注意的是，一种不同的细菌铁结合蛋白，荚膜红杆菌的细胞色素 c₂，在配体结合位点紧邻处也有一个甘氨酸。当该残基变为丝氨酸时，该蛋白保持了其稳定性和体内功能，但蛋白中的氢键网络发生了改变。第二个突变使天冬酰胺变为赖氨酸，位于 169 位，这是一个面向远离柠檬酸盐口袋的螺旋的一部分。赖氨酸的更大、带电的 R 基团可能会将螺旋推入结合口袋并改变其对配体的亲和力。Graves 等人假设这些 fecA 突变损害了其转运柠檬酸铁的能力，进而损害了镓柠檬酸盐的转运，从而导致更高的镓耐受性。我们的结果暗示 FecA 不是镓柠檬酸盐导入的重要贡献者，而是在镓柠檬酸盐丰富时仍然导入铁。支持这一论点的证据也来自对内部化了镓的铜绿假单胞菌的直接测量，该菌拥有柠檬酸铁受体。当暴露于相同浓度的铁或镓柠檬酸盐时，细菌内部化的铁远多于镓，并且这些细菌对镓柠檬酸盐的导入效率并不比硝酸镓高，这与 Fec 系统对柠檬酸铁的强选择性一致。

删除 fecA 不仅消除了柠檬酸铁的转运，而且破坏了 FecA-FecR-FecI 信号级联。外膜受体 FecA 感知并导入柠檬酸铁，然后通过 FecB、FecC 和 FecD 穿过周质和内膜，由 ATPase FecE 提供动力。该系统的表达受胞外 sigma 因子 FecI 和抗 sigma 因子 FecR 的调节。FecI 上调 fecIR 和 fecABCDE 操纵子，但也可能将 RNA 聚合酶招募到其他位置。此外，FecI 诱导可能通过与其他 sigma 因子的竞争间接影响多种基因的表达。ΔfecA 突变体的镓敏感性可能至少部分是由于这些其他推定的基因表达变化。然而，仅在 M3 菌株中表达 fecABCDE 操纵子就增加了其镓抗性。该质粒不包括 fecI 或 fecR 基因。因此，对 Graves 等人发现的另一种解释可能是，镓抗性群体中 fecA 内的细微变化并未消除蛋白质功能，而是进一步增强了其对铁相对于镓的选择性，或实现了更强的信号响应导致产生更多的 FecA。克服 fecA 功能降低的适应度成本的补偿性突变也是可能的。

大多数铁获取基因由 Fur 协同调节，包括柠檬酸铁、耶尔森菌素和肠菌素系统。在一个仅拥有肠菌素和 fec 基因的菌株中，失活肠菌素途径会增加 fec 基因的表达。这也可以部分解释为什么 M12 entS 突变体在镓中存活得更好。在这种情况下，fecA 可能被上调以供应所需的铁，并且 trapped 在细胞内的肠菌素螯合镓，防止其破坏铁稳态。相反，当 fecA 缺失时，细胞可能 overexpress 肠菌素系统，从而导入更多镓并加剧其 effects。像 M12 这样包含多个铁获取系统（包括耶尔森菌素）的菌株，当 Fec 系统被破坏时是否会上调肠菌素 production 应加以研究。

我们假设 M12 ΔfecA 突变体对镓的敏感性是由于未能获取足够的铁来竞争过镓。M12 ΔfecA 仅需要 6.25 μM 或 1.56 μM 的补充亚铁或锰， respectively，来完全恢复在 800 μM 镓存在下的生长，但需要显著更高（50 μM）浓度的三价铁。这可能是由于有氧条件下三价铁的低溶解度，或者缺乏 fecA（三价铁的关键转运蛋白）。锰在挽救 M12 ΔfecA 生长方面比铁更有效。这可能源于其在抗氧化酶如 Mn-SOD 或低铁条件下核糖核苷酸还原酶 NrdEF 中的作用。补充锰也恢复了缺乏所有铁/锰转运蛋白的大肠杆菌菌株的镓抗性。我们发现 fecA 的缺失和镓暴露导致细胞内锰增加，这意味着铁短缺和氧化胁迫可能通过 active 增加锰摄取得到补偿。这可能源于铁饥饿期间 mntH 基因的上调，该基因编码一种 prefer 摄取 Mn²⁺ 但也可以导入 Fe²⁺ 的转运系统。

当存在 200 μM 镓时，M12 ΔfecA 突变体中的细胞内铁水平大约是野生型菌株的一半。在野生型菌株中，当镓存在时，铁水平仅略低，并且这在统计学上不显著。这表明野生型菌株可能在镓存在时上调铁转运基因，特别是 fecABCDE 基因。我们观察到在野生型中 fecA 启动子的明显上调，但在 M12 ΔfecA 突变菌株中，当在补充了镓的 Davis 肉汤中生长时则没有。这与对感知到的铁限制和柠檬酸铁（或镓柠檬酸盐）可用性的细胞反应一致。最近的一项转录组学研究也报道了在硝酸镓胁迫下上调的 Fe²⁺ 和 Fe³⁺ 导入系统，包括大肠杆菌中的 fecABCDE。Taudte 等人也发现细胞内铁水平不受生长培养基中镓的影响。我们检测到 ΔfecA 突变体中的细胞内镓略多于野生型菌株。总的来说，这些结果表明镓可能不是通过 FecA 进入，而是可以通过其他铁转运系统进入。这些转运蛋白对铁的 efficiency 远高于镓，并且镓的其他转运蛋白仍有待鉴定。

培养基中的镓减少了细胞内锌，并且 M12 ΔfecA 中的水平低于野生型菌株。镓可能干扰通过锌转运蛋白（如 ZupT）的摄取。已知 ZupT 以高亲和力结合锌、镉和铁；镓可能与铁竞争通过该途径的摄取。

fecA 的缺失也影响了对钴的敏感性，但不影响铜或银。钴可以在 vital 代谢蛋白的铁硫 [Fe-S] 簇合成过程中被掺入，导致蛋白质失活。缺乏参与 [Fe-S] 簇组装机制的菌株对钴过敏，并且钴处理增加了铁摄取基因的表达。该模型与我们观察到的 ΔfecA 突变体敏感性升高一致，该突变体可能无法完全 replenish 被钴损坏的 [Fe-S] 簇。未来的工作应包括测试钴和镓是否可能具有协同作用，尤其是在 FecA 被破坏时。

除了铁相关基因外，TnSeq 结果还鉴定出在同一操纵子中的另外两个基因 (ybeX 和 ybeZ)，预测它们以相反的方式影响 M12 在镓中的存活。YbeX 与核糖体代谢有关，并且该基因的缺失被证实增加了 M12 对镓的敏感性。另一方面，YbeZ 是一种推定的具有磷酸酶活性的 RNA 解旋酶，其缺失未可检测地影响 M12 在镓中的生长。已知 YbeX 在温度和抗生素胁迫响应中发挥作用。ybeX 的缺失可能放大了在镓存在下 ROS 介导的核糖体损伤。由于我们使用的 Tn5 构建体包含外向启动子，ybeX 上游（ybeZ 内）的转座子插入可能增加了其表达，从而导致更高的镓耐受性。

增强镓的抗菌效力可能是对抗耐药性的一种有前景的方法，包括在农业环境中。这将需要完全了解镓靶向的特定蛋白质，以及控制敏感性的生理反应。我们的研究通过强调 fecA 在维持铁稳态中的重要作用来促进这种理解，这有助于减轻镓毒性。此外，我们发现了锰在镓胁迫下的保护作用，通过帮助细胞在这些条件下存活。我们的结果可能会为未来制定使镓对大肠杆菌更有效的策略提供信息。具体来说，尽管镓柠檬酸盐可能无效，但将镓与肠菌素复合可能有效。同时用抗体、化学品或适体干扰 FecA 和 MntH 蛋白可能会使肠菌素-镓缀合物更有效。鉴于 Fec 和 MntH 系统在 ExPEC 尿路感染、败血症和乳腺炎中的重要作用，该策略可能具有广泛的适用性。

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains and conditions

大肠杆菌菌株 M3、M12、M34、M44 和 M66 先前从患有临床乳腺炎的牛的牛奶样本中分离出来。对于常规生长，将菌株从冷冻储备中划线于 Luria-Bertani (LB) 琼脂上，并在 37°C 下生长。液体培养物在补充了 0.1% (wt/vol) 酪蛋白氨基酸的 Davis 肉汤中生长。在细菌在镓存在下生长的条件下，将新鲜的 1 M 硝酸镓水合物（Sigma-Aldrich）储备液制备在 70% 乙醇中，根据需要稀释以达到 Davis 肉汤中的所需浓度。需要时，向生长培养基中补充卡那霉素（50 μg/mL）或氨苄青霉素（100 μg/mL）。

Transposon sequencing

为准备用于转座子测序的 DNA，将 M12 转座子突变体文库的 10 个小瓶汇集并在 Davis 肉汤中 overnight 生长。第二天，在两种条件下在 Davis 肉汤中制备重复的传代培养物：一种不含 Ga(NO₃)₃，另一种含 800 μM Ga(NO₃)₃。将这些培养物 overnight 生长，并使用 gBAC mini genomic DNA kit (IBI Scientific) 从每个培养物中分离总 DNA。如前所述，扩增转座子插入连接处并准备进行测序。在 SeqCenter（Pittsburgh, PA, USA）的 NextSeq 2000 P1 Illumina reads（单端）上生成 Illumina 100 bp reads。通过将先前生成的 Illumina 短读段映射到由 Plasmidsaurus (Louisville, KY, USA) 生成的 Oxford Nanopore 长读段组装，生成了 M12 菌株的闭合、高质量基因组序列。使用它们的条形码分离每个样品的序列，并使用 STAR aligner 映射到 M12 基因组。对于对照样品，在重复 1 和 2 中，分别有 2,066,541 和 1,812,044 个读段映射到 M12 基因组。在镓处理的样品中，第一个和第二个重复分别有 1,383,488 和 1,336,748 个读段被映射。使用 Geneious (Biomatters) 中的 DESeq2 包分析每个基因的原始计数表。使用 DESeq2 执行的负二项分布计算折叠变化值的 log₂ 转换和 P 值。通过 log₂ 折叠变化 >2 或

Gene deletion

使用质粒 pFOK 或 pAX1 通过等位基因交换创建无标记缺失。使用列于表 S1 中的引物，用 Q5 high fidelity mix (NEB) PCR 扩增目标基因上游和下游约 500 bp 的区域。对于克隆，用 EcoR1 (pFOK) 或 SalI 和 AvrII (pAX1) 线性化载体并进行凝胶纯化。使用 HiFi assembly mix (NEB) 组装载体和侧翼区域，并转化到电感受态 PIR 细胞 (ThermoFisher) 中。将所得质粒转化到化学感受态 MFDpir 中，用于通过与野生型菌株接合产生 merodiploids。为了选择第二次交叉事件和整合质粒的丢失，将培养物铺在含有 20% 蔗糖和 0.5 μg/mL anhydrotetracycline（用于 pFOK）的