铜绿假单胞菌LasR缺陷株对甲基乙二醛敏感性机制：胞内谷胱甘肽水平降低与CbrA-CbrB-Crc信号通路的调控作用

本研究揭示了临床常见LasR突变型铜绿假单胞菌对甲基乙二醛（MGO）敏感性增强的机制，发现其胞内还原型谷胱甘肽（GSH）水平降低及CbrAB-Crc调控通路高活性共同导致MGO解毒能力下降。该发现为理解病原体在感染过程中的适应性进化提供了新的代谢视角。

　　

ABSTRACT

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为一种常见病原体，在多种感染过程中常出现LasR转录因子的功能缺失突变。本研究发现，LasR缺陷株对甲基乙二醛（Methylglyoxal, MGO）的敏感性显著增强。MGO是一种高反应性亲电化合物，可由多种细胞（包括免疫防御相关细胞）产生，其毒性源于与生物大分子形成加合物。GloA3是一种依赖谷胱甘肽（GSH）的乙二醛酶，参与MGO的解毒过程。通过多种方法检测，发现?lasR突变株的胞内GSH水平较低。外源添加GSH或过表达GloA3均可增强MGO抗性，尤其在?lasR背景中效果显著。既往研究提示，LasR缺陷株的生长优势部分源于CbrAB双组分系统活性升高，进而减轻Crc介导的翻译抑制。本研究的遗传学数据表明，Crc活性降低会加剧LasR缺陷株的MGO敏感性，但这一效应并非通过影响GSH或GloA3实现。综上，LasR缺陷株的MGO高敏感性由多种因素导致，包括胞内GSH水平降低和Crc活性下降，这些因素可能是其适应性进化的代价。

INTRODUCTION

甲基乙二醛（MGO）是一种内源性产生的高反应性二羰基化合物，广泛存在于活细胞中。它由糖或甘油代谢中间体（如甘油醛-3-磷酸和二羟基丙酮磷酸）自发产生。MGO可与蛋白质、核酸和脂质的氨基反应形成加合物，造成细胞损伤。细胞依赖乙二醛酶系统解毒MGO，该系统包括乙二醛酶I（Glo1）和乙二醛酶II（Glo2），并以还原型谷胱甘肽（GSH）为辅因子。Glo1催化MGO–GSH半缩硫醛生成S-D-乳酰谷胱甘肽，Glo2将其进一步转化为D-乳酸。此外，多种生物还存在GSH非依赖型乙二醛酶和NADPH依赖型MGO还原酶等解毒途径。MGO水平在感染、癌症、糖尿病、痴呆、囊性纤维化（CF）及肝肾疾病中升高，与糖酵解增强、GSH水平降低或MGO代谢酶减少等因素相关。

铜绿假单胞菌是一种多重耐药病原体，可引发呼吸道、慢性伤口、眼部、耳部、尿路及血液感染。其致病性部分源于应对多种应激的能力。该菌拥有三种推测的乙二醛酶I编码基因：GloA1、GloA2（镍/钴依赖）和GloA3（锌依赖）。MGO的解毒依赖GSH的共价修饰，后者由GshA和GshB依次合成。gshA和gshB突变体对多种应激源（如抗生素、漂白剂、过氧化氢和MGO）敏感。

由于铜绿假单胞菌对抗生素的固有耐药性，尤其是生物被膜状态下的多重耐药性，研究人员寻求替代抗菌策略。麦卢卡蜂蜜是一种来源于蜜蜂采集的Leptospermum scoparium花蜜的独特产品，可通过去极化和透化膜抑制铜绿假单胞菌生长。MGO是麦卢卡蜂蜜的主要抗菌成分，两者均可上调铜绿假单胞菌的gloA3表达。

铜绿假单胞菌群体在感染过程中常出现LasR功能缺失突变。LasR参与酰基高丝氨酸内酯介导的群体感应，并近期被证明通过CbrAB-Crc系统调控代谢。Crc是一种翻译抑制因子，调控非偏好碳源摄取、应激反应等代谢过程。我们既往研究表明，LasR缺陷株具有更高的CbrAB活性和更低的Crc介导代谢抑制，这些变化赋予其在传代培养中的生长优势。LasR缺陷株常见于环境和感染部位，并与CF等疾病预后不良相关。值得注意的是，LasR突变体对过氧化氢等氧化应激源敏感，这与过氧化氢酶和NADPH生成脱氢酶的表达减少有关。然而，MGO对LasR缺陷株的影响尚不明确。

本研究旨在探究铜绿假单胞菌LasR缺陷株对MGO的敏感性及其机制，重点关注CbrAB-Crc通路和GSH依赖的解毒途径的作用。

RESULTS

铜绿假单胞菌lasR功能缺失株对胞外MGO敏感性增强

为评估铜绿假单胞菌对MGO的敏感性，将PA14野生型（WT）和?lasR突变株在含不同浓度MGO的LB平板上培养。在3–4.5 mM MGO范围内，WT菌落形成单位（CFUs）呈剂量依赖性下降，而?lasR突变株的CFUs显著低于WT。使用4 mM MGO进行后续实验。?lasR的回补株（?lasR + lasR）恢复了WT水平的MGO抗性。PAO1菌株的?lasR衍生株同样表现出比WT更高的MGO敏感性。所有菌株在无MGO培养基上生长均相似。

为进一步验证LasR活性缺失对MGO敏感性的影响，测试了多对临床分离的LasR+（功能正常）和LasR?（功能缺失）菌株。在LB平板上，LasR+和LasR?临床株对的CFUs相似；而在含4 mM MGO的培养基上，四对中的三对LasR?分离株CFUs低于LasR+对应株。总体而言，LasR?菌株对MGO的敏感性显著高于LasR+菌株。

CbrAB通路基因在MGO解毒中起重要作用

LasR缺陷株具有更高的CbrA-CbrB双组分系统活性，导致翻译抑制因子Crc的活性降低。为探究CbrAB-Crc通路活性差异是否贡献于WT与?lasR间的MGO敏感性差异，测试了?crc突变株的表型。?crc突变株在含4 mM MGO的LB平板上生长显著差于WT，且其敏感性与?lasR突变株相似。值得注意的是，?lasR?crc双突变株比单突变株更敏感，而回补crc基因可逆转该表型，提示LasR和Crc可能独立贡献于MGO抗性。

在WT和?lasR背景下，进一步删除cbrB（导致Crc活性升高）的影响。在?lasR突变体中，删除cbrB显著降低了MGO敏感性。?lasR?cbrB对MGO敏感性的降低可被cbrB回补逆转。与预期一致，?lasR?cbrB?crc三突变株（而非回补crc的菌株）相对于?lasR?cbrB表现出MGO敏感性升高。所有菌株在无MGO的LB培养基上生长均相似。这些结果表明，CbrAB-Crc调控的代谢影响MGO抗性，且该通路活性升高至少部分贡献于LasR缺陷株的MGO敏感性。

GSH和GloA3在抵御MGO中的作用

在铜绿假单胞菌中，GloA3是一种锌依赖型乙二醛酶I，参与MGO解毒。正如预期，gloA3::MAR2转座子突变株无法在含MGO的LB平板上生长，而gloA1::MAR2突变株与WT无显著差异。gloA3突变体的MGO敏感性可通过质粒组成型表达gloA3（pgloA3）回补，但空载体pMQ70_EV（pEV）无此效果。WT + pgloA3菌株在MGO平板上的生长略优于WT + pEV，但差异不显著。在无MGO培养基上，含pgloA3或pEV的WT或gloA3突变株CFUs无显著差异。

GloA3活性依赖GSH。铜绿假单胞菌PAO1菌株需要gshA和gshB进行MGO解毒。在PA14中，gshA::MAR2和gshB::MAR2转座子突变株对MGO高度敏感，但添加外源GSH可回补生长。相反，gloA3突变体的MGO敏感性无法被外源GSH挽救，表明GSH介导的MGO保护作用依赖GloA3。这些结果确认了GloA3和GSH在MGO抗性中的重要性。

LasR缺陷株胞内GSH水平降低

鉴于GSH在MGO抗性中的关键作用，探究了WT与?lasR菌株胞内GSH水平的差异。谷胱甘肽以还原型（GSH）和氧化型（GSSG）形式存在，其中GSH含量更高且是MGO解毒的主要形式。使用商业试剂盒检测液体培养的WT、?lasR和?lasR + lasR菌株的内源性GSH水平。发现?lasR突变体的GSH浓度低于WT和回补株；gshA突变体中未检测到GSH。类似地，PAO1 WT的GSH水平显著高于?lasR突变体。

通过非靶向代谢组学分析LB琼脂上生长的菌落生物被膜，发现?lasR菌落的GSH水平比WT低五倍。GSSG水平在两者中均低于GSH，但在?lasR中仍较低。在模拟CF气道营养环境的人工痰培养基（ASM）上生长的菌落生物被膜中观察到相同趋势。

有趣的是，尽管?crc突变体对MGO比WT更敏感，但其GSH水平与WT和回补株相似，且外源GSH无法挽救?crc菌株的MGO敏感性。这些数据与遗传学分析一致，提示LasR和Crc对MGO抗性的贡献至少部分独立。GSH水平差异与gshA mRNA水平无关：WT、?lasR和?crc菌株在有无MGO条件下gshA的标准化表达量均相似。这些结果表明，谷胱甘肽（尤其是GSH）水平降低可能增加LasR缺陷株对MGO的敏感性，且该效应可能非Crc介导。

GSH和GloA3对?lasR MGO敏感性的影响

为验证“LasR缺陷株因GSH水平降低而对MGO更敏感”的模型，测试了外源GSH能否挽救?lasR突变体的表型。在含MGO的LB培养基中添加GSH可显著提高WT和?lasR突变体的生长，但仅WT完全恢复至无MGO培养基的水平。此外，既往报道的LasR缺陷株对H₂O₂的敏感性可被外源GSH完全挽救。

评估了GSH与gloA3过表达的联合效应。在?lasR突变体中，pgloA3提高了含MGO培养基上的CFUs，但未完全恢复敏感性；添加外源GSH进一步增加了CFUs，并消除了含pgloA3和pEV菌株间的差异。WT和?lasR间的gloA3表达差异无法解释MGO敏感性变化。类似地，?crc突变体中gloA3过表达可提高含MGO培养基上的CFUs，且gloA3表达差异与敏感性无关。这些结果提示，在?lasR菌株中，GSH是GloA3介导MGO解毒的限制因子。

DISCUSSION

本研究提出模型：LasR缺陷株对MGO的高敏感性至少部分源于胞内GSH水平降低。?lasR的胞内GSH浓度在浮游状态和表面附着细胞中均显著低于WT，且在PA14和PAO1菌株背景中一致。单独过表达gloA3未能完全消除WT与?lasR在含MGO培养基上的生长差异，但提高GSH可用性后可消除这些差异。结果还表明，CbrA-CbrB-crcZ-Crc通路（在LasR突变体中发生改变）贡献于MGO敏感性，但非通过改变GSH实现。上位性分析提示，LasR功能缺失还存在其他未知机制影响MGO敏感性。

MGO对感染中微生物的影响尚不充分理解。MGO具有抗菌特性，但微生物拥有解毒机制。研究发现，中性粒细胞产生的MGO和化脓链球菌的MGO解毒乙二醛酶I是影响细胞培养和动物模型结局的关键因素。MGO还削弱感染骨髓源性巨噬细胞对结核分枝杆菌的控制。本研究中铜绿假单胞菌临床分离株的MGO敏感性差异与既往在念珠菌中的发现相似：在单一感染者分离的Candida lusitaniae菌株中，MGO敏感性存在显著差异；CF临床分离株中Mrr1转录因子功能获得性突变导致MGO还原酶编码基因MGD1诱导表达，进而赋予MGO抗性和利用MGO作为碳源的能力。有趣的是，MGO可诱导Mrr1调控其他基因（如MDR1），导致对氟康唑的耐药性和其他细菌毒素抗性。因此，MGO及其在微生物细胞内的转化速率可能影响MGO诱导通路的活性。事实上，MGO可激活铜绿假单胞菌的CmrA通路，导致外排系统MexEF-OprN上调，进而贡献于抗生素耐药性。

在铜绿假单胞菌中，GSH及其合成基因gshA和gshB对MGO解毒至关重要。本研究发现，PA14和PAO1的lasR突变体GSH水平显著降低。在菌落生物被膜的代谢组学中，这些差异更明显。GSSG水平在所有样本中均低于GSH，且在WT中高于?lasR菌株，提示GSH水平差异更可能源于生物合成或总谷胱甘肽含量的变化，而非GSSG还原能力的差异。

GSH水平降低可能解释LasR缺陷株对MGO和H₂O₂敏感性的增加，但需要更多证据确定GSH在LasR突变体抵御ROS中的重要性。除解毒途径外，GSH还通过整合细胞氧化还原状态信息参与群体感应，因而可能存在LasR增强GSH水平的反馈环路。未来研究将探讨LasR缺陷株中MGO生成是否更高（可能源于CbrAB活性升高导致的葡萄糖代谢增强），进而影响胞内GSH水平。目前尚无证据表明铜绿假单胞菌生成MGO。

除MGO解毒外，GSH在细胞中具多种功能：抵御亚硝化和氧化应激，甚至贡献于抗生素耐药性。外源和内源GSH还可影响III型和VI型分泌系统、游动和群游运动、绿脓素生成和生物被膜形成。不同铜绿假单胞菌菌株（如LasR突变体）的GSH水平差异可能调控这些系统，但需进一步研究阐明这一关系。

我们既往证明代谢适应在LasR变异株进化和成功中起关键作用，但仍需考虑感染部位高MGO对LasR缺陷株的影响。本研究提示，MGO敏感性或低胞内GSH可能在特定环境下负向选择LasR缺陷株。我们认为，低GSH可能代表了LasR功能缺失相关代谢和调控优势的权衡，这些优势超过了MGO敏感性增加的代价。其他突变可能帮助LasR缺陷株抵御MGO，例如发现一株LasR临床分离株对MGO的敏感性低于其LasR+对应株，这可能源于上调GSH非依赖型MGO保护机制的突变。GSH非依赖型乙二醛酶已在白念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中得到表征，近期在铜绿假单胞菌中也有报道。最终，多种MGO解毒途径的存在可能贡献于铜绿假单胞菌在广泛环境中的适应能力。

MATERIALS AND METHODS

菌株和生长条件

本研究使用的铜绿假单胞菌菌株列于表S1。每周从-80°C保存的冻存菌种划线接种于LB琼脂平板（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、1.5%琼脂）。过夜培养时，挑取数个菌落转接至含5 mL LB液体的18?×?150 mm玻璃管中，37°C、200 rpm滚动培养16小时。通过电转将GenScript合成的pMQ70-gloA3质粒或空载体对照导入指定菌株。含质粒细胞在羧苄青霉素（平板300 μg/mL，液体150 μg/mL）维持下培养，并用0.2%阿拉伯糖（2 mg/mL）诱导。

甲基乙二醛和过氧化氢敏感性测定

过夜培养16小时的菌液用LB调整至OD₆₀₀=1，然后在96孔板中用200 μL超纯水进行10倍系列稀释。取5 μL各稀释度菌悬液点种于相应培养基，在生物安全柜中干燥30分钟后37°C培养16小时。计数最后有生长的稀释度（多于5个菌落）的菌落数，并拍摄平板图像。含MGO的LB琼脂通过将适量MGO（6.49 M液体，Sigma M0252）加入熔融LB琼脂中制备，并在3小时内使用。MGO工作浓度由新鲜制备的0.649 M filter-无菌储备液（超纯水配制）添加。H₂O₂平板类似制备，使用新鲜filter-无菌的0.98 M储备液（源自30% H₂O₂母液）添加至终浓度300 μM，并在3小时内使用。GSH挽救实验中，还原型L-谷胱甘肽（Sigma #G2451）用水稀释至100 mM，pH调至~7.4，filter-除菌后加入熔融LB琼脂至终浓度5 mM。平板在3小时内使用。

胞内GSH测量

细胞在5 mL LB液体中37°C滚动培养16小时，调整至OD₆₀₀=1.0。使用GSH/GSSG比值检测试剂盒II（Abcam #ab205811）测量胞内GSH。制造商方案适配于铜绿假单胞菌。简要而言，标准化细胞离心沉淀并用1 mL PBS洗涤。细胞速冻后-80°C保存至少24小时。然后，用TE+溶菌酶（~0.98 mg/mL）处理5分钟（RT）裂解细胞。后续步骤在冰上或4°C进行：细胞和碎片通过13,000 rpm离心15分钟去除。上清用三氯乙酸处理15分钟去除蛋白质。样本再16,000 rpm离心15分钟，上清用NaHCO₃调至pH=6。样本最大速度再次离心15分钟，上清用于后续步骤。为测量GSH，用1 mM GSH储备液（1:100稀释）制备八个GSH标准品（0-100 μM）。将GSH assay mixture（含thiol green）加入各样本和GSH标准品中，孵育30–60分钟。用荧光酶标仪（BioTek Synergy Neo2）在Ex/Em = 490/520 nm测量荧光。GSH标准品的荧光用于构建标准曲线，并计算各样本的GSH浓度。

统计分析和图表制备

所有图表用GraphPad Prism 10.2.0制备。单因素和双因素方差分析在Prism中进行；各检验细节见相应图注。所有P值均为双尾，P?P?P?P?P?

ACKNOWLEDGMENTS

我们感谢Nicholas Jacobs博士对数据和手稿的宝贵意见，以及Amy Conaway在适配GSH assay至铜绿假单胞菌中的协助。本研究受囊性纤维化基金会HOGAN19G0和T32 AI007519资助（A.A.）。额外支持来自NIGMS P20GM113132（通过分子互作与成像核心设施MIIC）、囊性纤维化基金会BOMBERG24R0和NIDDK P30-DK117469（达特茅斯囊性纤维化研究中心）。