COVID-19大流行不同时期呼吸机相关性肺炎患者下呼吸道微生物组特征与临床预后关联研究

本回顾性研究系统分析了上海COVID-19大流行不同时期（前/中/后）VAP患者下呼吸道微生物组特征。通过宏基因组测序（NGS）技术发现，大流行期间组（Dur组）微生物α-多样性显著降低（P<0.05），肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、烟曲霉和HSV-1检出率升高。多变量Cox回归显示APACHE II评分（HR=1.04）和最大细菌载量（HR=1.67）是ICU死亡的独立风险因素。研究为流行病期间VAP的精准治疗提供了微生物组学依据。

　　

研究背景与设计思路

重症监护室（ICU）是医院内感染发生率最高的医疗单元，其中呼吸道感染占比达53.73%–64.7%。呼吸机相关性肺炎（VAP）作为ICU获得性感染的主要临床表现，是导致ICU患者死亡的主要原因之一。新型冠状病毒感染（COVID-19）引起的SARS-CoV-2病毒感染可进展为肺炎和呼吸衰竭，且常伴随合并感染。越来越多的证据表明，SARS-CoV-2感染可能改变鼻腔、口咽、肠道和肺部的微环境，导致微生物失调，这种失调可能使个体易患继发感染或并发症，从而导致COVID-19患者更高的发病率和死亡率。

本研究采用回顾性分析方法，纳入2021年1月1日至2023年10月1日期间复旦大学附属中山医院ICU收治的175例VAP患者。根据上海市首次COVID-19封锁时间、患者病史和临床检查结果，将患者分为三组：流行前组（Pre组，58例）为在上海疫情暴发前入住ICU、SARS-CoV-2 PCR检测阴性且无感染史的患者；流行期间组（Dur组，58例）为在当地疫情暴发期间入住、经鼻咽/口咽PCR检测SARS-CoV-2阳性的患者；流行后组（Post组，59例）为疫情缓解后入住、有SARS-CoV-2感染史但当前ICU入院时PCR检测阴性的患者。

研究方法与实验设计

所有患者均接受气管插管、机械通气，并接受纤维支气管镜检查采集支气管肺泡灌洗液（BALF），用于治疗和下一代测序（NGS）检测。血液样本在NGS检测当天采集，用于检测D-二聚体、C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、铁蛋白和血清细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10）水平。通过流式细胞术分析淋巴细胞亚群，包括T细胞（CD3⁺）、B细胞（CD3^?CD19⁺）、辅助/诱导T细胞（Th，CD3⁺CD4⁺）、细胞毒性T细胞（Tc，CD3⁺CD8⁺）和自然杀伤细胞（CD3^?CD16⁺CD56⁺）。

BALF样本通过标准程序采集，使用QIAamp UCP病原体迷你试剂盒提取核酸，采用Nextera DNA Flex试剂盒制备文库，在Illumina NextSeq 550测序仪上使用75循环单端测序策略进行测序。生物信息学分析使用Trimmomatic去除低质量读段，通过Kraken2标准从NCBI汇编和基因组数据库中选择微生物基因组构建数据库，使用Burrows-Wheeler Aligner软件将微生物读段与数据库进行比对。定义与参考序列90%同一性的读段为映射读段，每千万读段（RPTM）进行标准化以消除样本间测序深度差异带来的误差。

患者基线特征与免疫指标分析

三组患者在APACHE II评分（P=0.225）和SOFA评分（P=0.710）方面无差异，但Dur组患者年龄较大（P<0.001），Charlson评分高于Pre组（P<0.01）。Post组类固醇或免疫抑制剂使用率高于Pre组（P<0.05）。ICU总死亡率为45.7%，三组死亡率分别为48.3%（Pre组）、60.3%（Dur组）和28.8%（Post组）。组内分析显示，死亡患者的SOFA评分均高于存活患者（三组均P<0.001）。

细胞因子水平分析显示，Pre组和Dur组的TNF-α、IL-8和铁蛋白水平高于Post组，而IL-1β、IL-2R和IL-10水平在Pre组高于Post组。Dur组的PCT水平显著低于Pre组和Post组。在Pre组和Dur组中，死亡患者的TNF-α、IL-1β、IL-2R、IL-6和IL-8水平高于存活患者，而血小板水平显著较低。Post组中，除CD56和CRP在死亡患者中升高外，存活与死亡患者间无显著差异。

抗生素使用分析显示，三组在大多数抗生素类别使用上无显著差异。最常用的抗生素是碳青霉烯类（Pre组56.9%，Dur组53.4%，Post组55.93%；P=0.781）、第三代头孢菌素（20.69%，27.6%，20.34%；P=0.643）和糖肽类（17.2%，13.8%，30.51%；P=0.061）。

微生物组多样性分析

通过NGS对149份血清样本和143份BALF样本中的微生物检测显示，BALF中检测到的微生物多样性大于血清，细菌数量为35 vs 25，病毒为22 vs 19，真菌为19 vs 7。

BALF微生物相对丰度分析显示，Pre组最丰富的三个属是不动杆菌属（26.07%）、假单胞菌属（10.93%）和窄食单胞菌属（8.12%）；Dur组为不动杆菌属（38.29%）、克雷伯菌属（15.45%）和肠球菌属（10.27%）；Post组为不动杆菌属（44.24%）、链球菌属（12.19%）和窄食单胞菌属（7.61%）。

物种水平上，Pre组最常见的是鲍曼不动杆菌（23.07%）、铜绿假单胞菌（11.09%）和嗜麦芽窄食单胞菌（10.05%）；Dur组为鲍曼不动杆菌（31.47%）、肺炎克雷伯菌（12.26%）和嗜麦芽窄食单胞菌（6.76%）。Dur组肺炎克雷伯菌的丰度（12.26%）显著高于Pre组（3.1%）和Post组（6.64%）。粪肠球菌在Pre组中很少检测到（0.89%），但在Dur组（6.57%）和Post组（4.50%）中丰度较高。

α多样性分析显示，Pre组肺部微生物多样性高于Dur组和Post组，Post组呈现恢复趋势（P<0.05）。β多样性分析基于主成分分析（PCA）、Bray-Curtis主坐标分析（PCoA）和Bray-Curtis非度量多维尺度分析（NMDS）也证实了三组间的差异。

真菌检测结果

在BALF中共鉴定出19种真菌，以念珠菌属最为普遍（40.00%）。Pre组最常检测到的真菌属是念珠菌属（41.80%）、马拉色菌属（20.12%）和棒孢属（8.36%）；Dur组为念珠菌属（43.40%）、棒孢属（10.38%）和曲霉属（8.18%）；Post组为念珠菌属（34.69%）、毛孢子菌属（20.94%）和棒孢属（10.63%）。

物种水平上，Dur组白色念珠菌的相对丰度（33.63%）高于Pre组（30.01%）和Post组（18.70%）。秋葵毛孢子菌在Post组显著增加，从Pre组的2.81%上升到Post组的21.21%，Dur组为5.4%。烟曲霉呈现相似趋势，其丰度在Pre组为1.11%，Dur组为5.1%，Post组为4.80%。相反，限制马拉色菌从Pre组（16.48%）显著下降到Dur组（2.00%）和Post组（2.66%）。

病毒检测结果

在ICU患者的BALF中共检测到23种病毒。Pre组最常见的三种病毒是细环病毒（26.33%）、巨细胞病毒（CMV，11.80%）和单纯疱疹病毒1型（HSV-1，11.06%）；Dur组为HSV-1（35.94%）、SARS-CoV-2（30.33%）和EB病毒（EBV，11.29%）；Post组为细环病毒（17.65%）、HSV-1（17.28%）和EBV（13.74%）。

Dur组HSV-1的相对丰度显著增加，而细环病毒显著减少。此外，甲型流感病毒H1N1和甲型流感病毒H3N2从Pre组的0%分别上升到Post组的3.25%和2.73%。LEfSe分析确定了Pre、Dur和Post组间的判别性微生物特征。铜绿假单胞菌、HSV-1和停乳链球菌分别被确定为Pre、Dur和Post组中富集的物种。

存活与死亡患者微生物组比较

根据相对丰度，存活组最常见的属是不动杆菌属（31.61%）、链球菌属（11.76%）和克雷伯菌属（10.32%）；死亡组为不动杆菌属（42.47%）、克雷伯菌属（10.55%）和假单胞菌属（9.11%）。

物种水平上，存活组最普遍的细菌是鲍曼不动杆菌（28.77%）、嗜麦芽窄食单胞菌（10.98%）和肺炎克雷伯菌（7.82%）；死亡组为鲍曼不动杆菌（51.08%）、肺炎克雷伯菌（11.85%）和铜绿假单胞菌（11.58%）。死亡组中鲍曼不动杆菌（存活组vs死亡组：28.77% vs 51.08%）和粪肠球菌（1.87% vs 9.61%）显著增加。α多样性和β多样性在存活组和死亡组间无差异。

LEfSe确定存活组和死亡组间的判别性微生物特征。死亡组中伊丽莎白菌为特征性细菌，而存活组中假肺炎链球菌被确定为富集物种。

死亡率风险因素分析

Cox比例风险回归分析评估了多个因素对结局事件风险的影响。逐步筛选后，最终模型保留了三个变量：年龄（HR=1.01，95% CI [0.99，1.03]，P>0.05）、APACHE II评分（HR=1.03，95% CI [1.00，1.07]，P=0.028）和最大细菌序列计数（HR=1.00，95% CI [1.00，1.00]，P<0.001）。

使用Maxstat方法确定最大细菌序列计数的最佳截断值为167314，并将其重新分类为二分类变量进行后续Cox回归分析。调整后的模型保留了四个变量：年龄、性别、APACHE II评分和最大细菌序列计数大于167314。结果显示，APACHE II评分（HR=1.04，95% CI [1.00，1.07]，P=0.029）和最大细菌序列计数（HR=1.67，95% CI [1.01，2.77]，P=0.046）与结局事件风险显著相关。年龄（HR=1.02，95% CI [1.00，1.03]，P=0.064）和性别（HR=0.64，95% CI [0.37，1.12]，P=0.121）未达到统计学显著性，但年龄的影响接近显著性。

讨论与结论

COVID-19大流行已进入稳定阶段，并逐渐被视为与流感病毒类似的地方性疾病。COVID-19感染的长期影响日益引起研究人员的关注。重症患者可能因COVID-19感染患上肺炎，或有既往感染史入住ICU。目前关于COVID-19疫情前后ICU患者病原微生物变化的研究较少。合并感染和重复感染在危重患者中常见，且与不良预后相关。

由于COVID-19患者免疫功能、呼吸屏障和肺部微环境的改变，感染病原谱可能有所不同。本研究通过NGS分析调查了COVID-19疫情前、期间和后期ICU中VAP患者的微生物组组成。

在危重患者中，由细菌、真菌或病毒引起的重复感染的出现使临床病程大大复杂化。NGS的出现克服了传统方法培养时间长、灵敏度低的缺点，允许同时检测多种微生物。其准确性和临床应用价值正在不断得到验证和证实，研究表明其对呼吸道病原体的诊断性能与靶向定量聚合酶链反应（qPCR）检测相当。

在美国ICU中，与VAP相关的流行病因学因素按频率降序排列为：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌。而在欧洲ICU中，最常引起VAP的病原体依次为：肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。本研究中，鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌被确定为引起VAP的最常见病原体，这与最近中国全国VAP调查的结果一致。

尽管先前的研究表明VAP的病因在COVID-19和非COVID-19患者之间没有差异，但我们的单中心分析发现了在上海医院不同疫情波次中收治的COVID-19患者具有不同的病原体谱。肺炎克雷伯菌和粪肠球菌的相对丰度在不同组间显示显著变化，粪肠球菌在当地COVID-19暴发急性期显著增加，并在疫情高峰后持续保持升高水平。此外，微生物多样性在Pre、Dur和Post组中呈现先下降后恢复的趋势。这些发现表明，COVID-19感染破坏了原有的微生物平衡，损害了肺部微生物多样性，并可能引发肠道微生物群移位。

最近的研究强调了肠道微生物群与肺部之间的相互作用，通常称为"肠-肺轴"。SARS-CoV-2可以直接或间接诱导肠道微生物群失调。例如，病毒感染引发炎症反应，促使细胞因子（如IL-6和TNF-α）释放。这些介质可以破坏肠道微生物群的平衡并损害肠道屏障。此外，由此产生的失调和微生物移位可能加剧炎症反应，形成恶性循环。

在本研究中，我们未观察到Dur组相比Pre组炎症增加或免疫耐受的证据，这与先前的研究似乎不一致。具体来说，与Pre组相比，Dur组细胞因子水平没有升高，白细胞计数及其亚群也没有发现统计学显著差异。在组内分析中，我们观察到在Pre组和Dur组中，死亡亚组的炎症水平显著高于存活亚组。有趣的是，在Post组中，炎症反应似乎更为抑制，细胞因子水平普遍低于Pre组和Dur组。此外，除CRP和CD56水平升高外，存活和死亡亚组间未观察到其他细胞因子水平的显著变化。我们假设，曾感染并康复的COVID-19患者可能经历免疫衰竭或耐受。

我们进一步描述了这些患者BALF中的真菌检测情况。尽管NGS结果不能明确指示念珠菌种类是侵袭性的还是定植的，但念珠菌，特别是白色念珠菌，是本研究中最常检测到的真菌。而且，Dur组白色念珠菌的相对丰度最高。这一发现与先前的研究一致，已有报道称COVID-19患者中念珠菌血流感染的发生率是非COVID-19患者的2-10倍。白色念珠菌是危重COVID-19患者中最常报告的酵母菌种类，在美国的一项多中心研究中占念珠菌血流感染病例的44%。2020年初，中国报告了首例COVID-19相关肺曲霉病。此后， several病例系列和队列研究强调了这种潜在危及生命的继发感染的重要性。在本研究中，我们也观察到Dur组和Post组中曲霉种类的检测显著增加。

最近的研究表明，COVID-19感染可引发疱疹病毒种类的再激活，导致病毒作为COVID-19的合并感染持续存在。迄今为止，已鉴定出八种疱疹病毒类型。其中最常见的是HSV-1、HSV-2、水痘-带状疱疹病毒、HSV-6、EBV和CMV。已发表的研究证明，COVID-19患者中的病毒再激活或合并感染可能导致危重患者的死亡率显著升高。一项观察性队列研究发现，HSV再激活在接受机械通气的COVID-19患者中很常见，而CMV再激活较少见。此外，HSV的动态病毒载量与增加的90天死亡率相关。在本研究中，HSV-1、EBV和CMV在BALF中被检出且相对丰度升高。值得注意的是，Dur组HSV-1的相对丰度显著高于Pre组和Post组。有趣的是，CMV的相对丰度在Dur组呈现下降趋势。尽管我们的研究未证明EBV、HSV的检测与死亡风险增加有直接关联，但这可能受到回顾性设计、小样本量以及无法确认这些病毒是否再激活的限制。

研究表明，COVID-19感染后免疫状态的改变将直接影响宿主微生物组，尤其是病原体的多样性。COVID-19感染的急性阶段及其引发的免疫反应可能通过抗生素使用、炎症反应和氧化应激等机制导致宿主正常微生物组的丧失，甚至健康菌群失衡。此外，COVID-19感染后的免疫失调或免疫逃逸可能为特定病原体的增殖提供有利条件。某些病原体，如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和真菌（如白色念珠菌），可能在免疫系统不平衡时获得繁殖优势。COVID-19感染可能导致病毒-细菌合并感染，进一步改变细菌群落的多样性。

作为一项高通量技术，NGS近年来已广泛应用于传染病的诊断和监测。细菌载量是指感染部位或体内存在的细菌数量或浓度，通常被认为是影响临床结局的关键因素。例如，在危重患者中，如脓毒症和严重肺炎，较高的细菌载量通常与不良临床结局相关。我们的研究发现，最大细菌序列计数大于167314是一个显著的死亡风险因素。病原体载量不仅影响疾病的临床表现，而且与患者的免疫反应密切相关。研究表明，免疫缺陷或免疫抑制患者通常具有较高的细菌载量，这些患者通常无法有效清除体内病原体，导致疾病恶化。此外，过高的细菌载量也可能导致过度免疫反应，从而加剧炎症反应并诱发继发性损伤，进一步恶化预后。

虽然我们的研究结果证明了大流行不同阶段下呼吸道微生物组的显著变化，但这些结果必须在多个共同演变的临床和流行病学因素的背景下进行解释。尽管ICU入院标准在理论上可能发生变化，但三组患者的基线疾病严重程度总体可比，APACHE II和SOFA评分无显著差异证明了这一点。然而，关键的人口统计学和临床差异可能作为混杂因素。具体来说，流行期间组的患者年龄较大，Charlson评分测量的合并症负担较高，而Post组的类固醇或免疫抑制剂使用率显著更高，所有这些都可以独立地影响气道微生物组。关于抗菌药物压力，我们的分析显示，大多数个体抗生素类别的使用在三组间基本相当，表明这可能不是观察到的微生物变化的主要驱动因素。此外，大流行相关的激增可能影响了常见VAP病原体的医院传播动态。因此，虽然SARS-CoV-2感染似乎是一个关键因素，特别是在降低微生物多样性方面，但观察到的VAP微生物组变化必须被理解为一个多因素现象，反映了病毒、不断变化的患者特征、临床实践和ICU环境之间复杂的相互作用。

承认研究的局限性至关重要。首先，本研究仅关注下呼吸道病原微生物存在的检测结果，判断它们是致病菌还是定植菌留给临床医生。此外，对这些病原体的正交验证也至关重要。未来的研究将整合qPCR或其他靶向方法学来确认病原体的存在和载量，从而旨在为其临床意义提供更严格的证据。其次，作为一项单中心回顾性研究，它存在潜在的选择偏倚。尽管Pre组和Dur组具有可比性，但Post组的ICU入院病因谱与其他两组不同，可能混淆微生物组分析。需要前瞻性和多中心研究来进一步证实。第三，NGS技术存在一些固有缺陷，检测结果容易受到试剂盒相关背景微生物和核酸的污染。NGS技术的进步和更新有望解决这个问题。

总之，我们的研究表明，BALF中细菌、真菌和病毒的相对丰度可能随着疫情的进展而改变。然而，SARS-CoV-2感染及其后果对危重患者的影响仍需进一步研究。未来，随着测序技术的进步和成本的降低，NGS可能成为常规诊断和监测工具，特别是在评估严重感染和合并感染的预后方面。需要采用标准化和全面的微生物学采样在开始抗菌治疗前进行前瞻性研究，以更好地描述COVID-19患者的合并感染和继发感染特征。