快速精准定量活体卡氏棘阿米巴包囊新策略：显著提升消毒剂效能评估效率

本刊推荐：本研究针对致病性卡氏棘阿米巴（AC）包囊存活量检测周期长（7天）的瓶颈，创新性地开发出基于胎牛血清（FBS）浓度优化与CO2环境调控的快速检测方案。通过添加≥5% FBS的肽-酵母提取物-葡萄糖（PYG）培养基并结合≥2.5% CO2培养环境，成功将检测时间缩短至3天，且保持与传统方法相当的准确性（LACC检测）。该方案为消毒剂抗包囊效能评估及环境稳定性研究提供了高效技术支撑，对防控棘阿米巴角膜炎（AK）具有重要实践意义。

　　

引言

卡氏棘阿米巴（Acanthamoeba castellanii, AC）是一种广泛分布于土壤和淡水环境中的原生生物，作为机会性病原体，可引发难治性棘阿米巴角膜炎（Acanthamoeba keratitis, AK）和肉芽肿性阿米巴脑炎。其生命周期包括活跃生长的滋养体和不生长、代谢极低的包囊两种形式。在恶劣环境下，滋养体可转化为包囊，从而对多种抗菌/抗真菌药物、消毒剂及苛刻环境产生强抵抗性。AC包囊的高耐受性使得有效消毒成为防控AK的关键挑战。

当前检测活AC包囊的常规方法需7天完成，严重限制了消毒剂效能及环境稳定性评估的效率。虽然基于代谢活性或ATP含量的检测法可快速判定滋养体存活，但这些方法不适用于包囊。近期发展的光反应染料联合活性PCR检测虽能快速识别活包囊，但难以实现绝对定量。因此，通过长期培养并肉眼观察包囊脱囊（excystation）仍是准确量化具有脱囊增殖潜力（即致病性）活包囊的金标准。

研究方法与结果

本研究通过优化培养条件显著缩短了检测时间。将AC标准株（ATCC 50492）和临床分离株（AC-W、AC-U）包囊接种于96孔板，在肽-酵母提取物-葡萄糖（peptone-yeast extract-glucose, PYG）培养基中培养，并系统调整胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）浓度（0%、2.5%、5%、10%）与CO₂环境（0.04%、2.5%、5.0%）。通过倒置显微镜逐日观察脱囊情况及滋养体增殖，采用Spearman-Karber法计算活包囊计数（Living AC Cyst Counts, LACC）。

关键发现：

1. 1.

   脱囊与增殖速率：

   • •

     在0.04% CO₂（即空气环境）下，添加5% FBS可轻微促进脱囊；而5.0% CO₂环境下，脱囊显著加速，半数包囊在第二天即发生脱囊。若同时添加5% FBS，几乎所有包囊均脱囊。

   • •

     培养第三天，5.0% CO₂结合5% FBS的条件下，可见活跃的滋养体增殖，且增殖数量显著增加。

2. 2.

   LACC检测时间：

   • •

     对于高浓度样本（5 Log₁₀ LACC/mL），常规空气环境下LACC在第6天达到稳定；而在≥2.5% CO₂环境下，第4天即达稳定。添加≥5% FBS后，在≥2.5% CO₂条件下仅需3天即可完成检测。低浓度样本（3 Log₁₀ LACC/mL）呈现相同趋势。

   • •

     所有测试AC菌株包囊在PYG培养基添加≥5% FBS且CO₂浓度≥2.5%的条件下，LACC均在3天内达到稳定值。

3. 3.

   检测准确性：

   • •

     所有方案的LACC检测差异均值低于0.15，95%置信区间为-0.5~0.5，表明新方案与传统7天方案准确性相当。

   • •

     针对经消毒剂苯扎氯铵（Benzalkonium Chloride, BAC）处理的样本，新方案（3天）与传统方案（7天）测得的对数LACC差异均值<0.10，置信区间为-0.25~0.25，验证了新方案在化学处理样本中的高准确性。

4. 4.

   培养基pH稳定性：

   • •

     在0.04%与5.0% CO₂环境下，PYG培养基pH分别稳定于7.0–7.1与6.8–6.9之间，表明CO₂促进脱囊并非通过pH调节实现，可能与模拟人体组织高CO₂分压环境有关。

讨论

本研究首次证实通过优化FBS浓度与CO₂环境可大幅加速AC包囊脱囊，使活包囊定量检测时间由7天缩短至3天，且精度不受影响。该方案显著提升了消毒剂抗包囊效能及环境稳定性评估效率，对AK预防具有重要实践价值。此外，该方法有望推广至其他阿米巴包囊的快速定量检测。

材料与方法

AC滋养体使用PYG培养基于30°C静置培养，包囊通过Neff’s脱囊培养基诱导6–7天成熟，并经0.5%十二烷基硫酸钠处理去除残留滋养体。LACC检测采用系列稀释法，通过显微镜观察脱囊及滋养体增殖情况，以Spearman-Karber法计算。化学处理样本使用10–100 ppm BAC暴露1–6小时后检测。数据以均值±标准误表示，统计通过GraphPad Prism 7完成。

致谢

研究得到Lotte研究促进基金、Takahashi产业经济研究基金会和武田科学基金会支持。英文编辑由Editage完成。