临床可用水凝胶联合1.77 cm2电化学生成次氯酸电子敷料对抗金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌生物膜的研究

本研究评估了七种临床可用水凝胶（包括黄原胶、3M、Duoderm、Prontosan、Purilon、Skintegrity和Solosite）与1.77 cm2次氯酸（HOCl）生成电子敷料（e-bandage）联用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和鲍曼不动杆菌生物膜的体外抗菌效果。结果显示，除Solosite外，所有水凝胶在6小时极化处理后均能实现≥5.5 log10CFU/cm2的细菌减少量，多数低于检测限。研究为临床选择适用于HOCl电子敷料的水凝胶提供了重要依据。

　　

引言

皮肤作为人体最大的器官，约占体重的16%，是抵御毒素、微生物和环境化学物质的第一道防线。当这一保护屏障受损时便会形成伤口；若皮肤损伤愈合延迟，则可能发展为慢性伤口。在这种愈合停滞状态下，慢性伤口易受感染，进一步阻碍皮肤修复。除感染外，慢性伤口因血流减少、持续炎症和上皮再生受损而愈合缓慢。大部分慢性伤口存在生物膜，这是成功愈合的主要障碍。慢性伤口微生物群种类多样，包括需氧和厌氧的革兰阳性及阴性细菌以及真菌。常见的伤口感染病原体包括粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属。

生物膜相关伤口感染顽固难治，给医疗系统带来经济负担。由于生物膜结构和环境使病原体得以存活，这类感染难以治疗。传统抗生素治疗增加了选择耐药菌的风险。非抗生素方法如抗菌肽、表面活性剂、脂肪酸和金属螯合剂已被开发用于预防和治疗生物膜，但这些技术的临床转化常面临困难。因此，需要新型且可转化的抗菌伤口感染预防、治疗和愈合技术。

次氯酸（HOCl）是一种具有强效抗菌活性的活性氧物种，用于临床医学中的感染控制和伤口愈合。它由中性粒细胞自然合成，作为机体防御病原体的一部分。HOCl通过损伤细胞成分杀死细菌：穿透细胞壁，抑制DNA和蛋白质合成及细菌生长。它还通过降低ATP生产影响细菌代谢，这表明细菌难以通过暴露于HOCl而产生耐药性。尽管具有治疗潜力，HOCl的应用存在局限性：液态HOCl不稳定，降解后疗效下降，限制其临床应用。Vashe伤口清洁溶液OTC（含HOCl）是解决这一限制的一种方法；另一种方法是使用电化学敷料（e-bandage），持续提供新鲜生成的低浓度HOCl。

在先前工作中，开发了1.77 cm²的e-bandage，可连续生成低浓度HOCl，并证明其在体外、离体和/或体内对单种和双种生物膜（包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA）的有效性。暴露于电化学生成的HOCl 10次后，未选择出MRSA和铜绿假单胞菌生物膜的耐药性，凸显了选择HOCl耐药性的风险极低，与其作用机制一致。e-bandage由碳织物工作电极（WE）和对电极（CE）（1.77 cm²）以及银-氯化银（Ag/AgCl）准参比电极组成，电极间用棉织物层分隔，并用硅胶粘合剂固定。电极周围是加载氯化钠（NaCl）的水凝胶，作为电解质。e-bandage工作电极在1.5 V_Ag/AgCl极化下通过氯离子氧化生成HOCl。

覆盖e-bandage的水凝胶提供电解质，实现离子导电性，同时保持湿润环境。迄今为止，HOCl生成1.77 cm² e-bandage的功效已使用黄原胶和有限程度地使用3M水凝胶得到证明。对于临床应用，可能需要使用除此之外的其他临床可用水凝胶。本研究的目标是鉴定与1.77 cm² HOCl生成e-bandage兼容的水凝胶，就其对抗临床相关耐药细菌生物膜的体外活性而言。本研究评估了七种临床可用水凝胶（黄原胶、3M、Duoderm、Prontosan、Purilon、Skintegrity和Solosite），并添加0.9% NaCl以增加离子导电性。测试了1.77 cm² HOCl生成e-bandage与七种水凝胶对MRSA IDRL-6169和鲍曼不动杆菌ATCC-17978生物膜的活性。

材料与方法

使用来自J. T. Baker、Sigma-Aldrich和Fisher Scientific的分析级化合物。研究了3M、Duoderm、Prontosan、Purilon、Skintegrity和Solosite水凝胶。包括黄原胶作为对照水凝胶，用于先前研究。此外，将先前使用3M水凝胶的结果与本文生成的结果进行了比较。

e-bandage构建

实验设置如图所示。1.77 cm² e-bandage的构建、应用和细节已有描述。简要来说，e-bandage是一个电化学系统，由三个电极组成：两层碳织物作为工作电极（WE）和对电极（CE）（1.77 cm²），而Ag/AgCl线作为准参比电极。电极用三层棉织物（每层2.25 cm²）分隔，并用硅胶粘合剂固定。电连接用30 AWG钛线建立，通过尼龙按扣压接，并连接到恒电位仪通过多路复用器。为确保电化学连接，WE和CE嵌入含0.9% NaCl的水凝胶中。使用前，e-bandage在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中浸泡约15分钟，然后在电极层之间加入100 μL含0.9% NaCl的水凝胶以确保所有组件水化和接触。

水凝胶整合到e-bandage中

每100克各水凝胶添加0.76克NaCl；1×PBS溶液通过将Na₂HPO₄、KH₂PO₄、NaCl和KCl溶解于18 Ω.m去离子水（1 L）中制备。黄原胶水凝胶由1×PBS与黄原胶（1.8% wt/vol）混合制成。水凝胶和PBS在121°C下高压灭菌15分钟，采用液体循环条件。

体外琼脂膜生物膜模型

使用已建立的基于琼脂的膜生物膜模型。对于生物膜培养，MRSA IDRL-6169和鲍曼不动杆菌ATCC 17978首先从-80°C库存划线分离，并在37°C培养24小时。使用两个菌落接种2 mL胰蛋白酶大豆肉汤，并在37°C以150 rpm摇动培养，直至培养物浊度相当于0.5 McFarland标准。随后，将2.5 μL培养物点种到UV灭菌的13 mm聚碳酸酯膜中心，该膜置于胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板表面。接种后的膜在37°C培养24小时。培养期后，量化“初始”细菌负载并记录为初始菌落形成单位每平方厘米（CFU/cm²）。初始值作为比较后续处理活性的基线。

e-bandage处理

在已建立的膜生物膜转移到新鲜TSA平板后进行e-bandage处理。将100 μL所需水凝胶用针头和注射器注入e-bandage棉织物层之间参比电极位置。额外100 μL水凝胶直接应用于生物膜，随后放置e-bandage，工作电极侧与生物膜接触。最后在e-bandage顶部添加100 μL水凝胶层。组装体用无菌Tegaderm透明薄膜敷料覆盖，e-bandage导线固定到TSA平板侧面。每个e-bandage连接到恒电位仪，配备多路复用器。工作电极在+1.5 V_Ag/AgCl极化，以允许在工作电极表面生成HOCl。使用非极化条件（不生成HOCl），采用相同设置但无电极极化。处理的生物膜（即那些带有极化e-bandage的）暴露于电化学生成的HOCl 1.5、3或6小时。

生物膜量化

处理后，e-bandage放入无菌培养皿，生物膜通过用5 mL PBS冲洗工作电极表面从工作电极表面移除。PBS和膜转移到15 mL离心管，涡旋2分钟，并在50 Hz超声5分钟以 dislodge 和 disaggregate 生物膜相关细胞。 resulting 超声液以2,910 × g离心10分钟，沉淀重悬于1 mL PBS。制备重悬液的10倍系列稀释， each 10 μL点种到TSA平板。剩余超声液（900 μL）铺板到单个TSA平板。平板在37°C培养24小时，之后计数CFU。结果表示为log₁₀ CFU/cm²。检测限为0.22 log₁₀ CFU/cm²，定义为接种900 μL未稀释样品的平板上产生两个菌落的量；如果观察到少于两个菌落，结果报告为0.1 log₁₀ CFU/cm²。

电化学活性测量

从1.77 cm² e-bandage集成水凝胶收集计时电流数据， while they were polarized using a恒电位仪配备多路复用器 at a constant potential of +1.5 V_Ag/AgCl。e-bandage处理设置就位后，使用相同的应用于生物膜的e-bandage进行测量。数据记录时e-bandage保持与生物膜接触 during polarization to assess electrochemical activity under treatment conditions。选择这种方法是因为生物膜存在于e-bandage下方可能影响测量的电流响应；因此，这种方法为评估e-bandage在生物膜处理期间的 electrochemical behavior 提供了更相关信息。

统计分析

数据表示为代表至少四个生物学重复（即在不同天进行的实验的结果）的个体数据点，误差条表示标准偏差。使用Wilcoxon秩和检验进行组比较，选择非参数检验。所有检验均为双尾；统计学显著性定义为P < 0.05。使用GraphPad Prism软件进行数据统计分析和图表生成。

结果

评估了水凝胶与HOCl生成1.77 cm² e-bandage配对对MRSA IDRL-6169和鲍曼不动杆菌ATCC-17978的体外活性。

图2显示了1.77 cm² HOCl生成e-bandage与水凝胶及对照黄原胶水凝胶对MRSA IDRL-6169生物膜在1.5、3和6小时的活性。使用黄原胶水凝胶 alone，非极化e-bandage组与初始组相比无显著减少，表明黄原胶水凝胶缺乏对MRSA的固有抗菌活性。加载黄原胶水凝胶的极化HOCl生成e-bandage表现出时间依赖性细菌减少。1.5小时后，观察到4.5 log₁₀ CFU/cm²减少，3小时后减少6.8 log₁₀ CFU/cm²，6小时后减少7.8 log₁₀ CFU/cm²；3和6小时处理显示与1.5小时处理相比显著减少。总体而言，加载黄原胶水凝胶的极化e-bandage在所有时间点对MRSA生物膜具有抗菌活性，6小时处理接近检测限。

3M水凝胶是一种无定形水凝胶，含丙二醇、瓜尔胶和四硼酸钠，设计用于填充伤口空腔并提供湿润愈合环境。丙二醇作为保湿剂，可湿润伤口床。当3M水凝胶用于非极化e-bandage时，与初始组相比无显著细菌减少。然而，极化HOCl生成e-bandage显示细菌减少；在1.5和3小时，处理的生物膜经历相似、显著的细菌负载减少，分别减少6.2和5.6 log₁₀ CFU/cm²。到6小时，细菌减少至低于检测限，6小时处理显示与1.5和3小时处理条件相比细菌负载显著减少。这表明3M水凝胶与极化HOCl生成e-bandage结合时提供有效的杀生物活性，适用于e-bandage。

Duoderm水凝胶含羧甲基纤维素基和果胶，设计用于提供湿润伤口环境。使用Duoderm水凝胶的非极化e-bandage组与初始组相比无显著细菌减少，表明Duoderm水凝胶 alone 对MRSA DIRL-6169生物膜无抗菌活性。当极化HOCl生成e-bandage结合Duoderm水凝胶时，有显著细菌负担减少。在1.5和3小时，分别观察到5.8和5.6 log₁₀ CFU/cm²细菌负载减少；6小时处理后细菌减少至低于检测限。这些发现显示极化HOCl生成e-bandage与Duoderm水凝胶结合时的活性，导致6小时内快速显著减少MRSA生物膜。

Prontosan水凝胶由甘油、羟乙基纤维素、甜菜碱和聚氨丙基双胍组成。甜菜碱是一种表面活性剂，可修饰细菌表面，从而可能促进生物膜和伤口碎片的移除。聚氨丙基双胍是一种抗菌剂，对革兰阳性和阴性细菌以及一些真菌物种具有活性。Prontosan水凝胶 proposed 提供伤口床清洁、湿润和去污活性。不出所料，Prontosan水凝胶 alone 对MRSA生物膜表现出抗菌活性； specifically，非极化e-bandage组在3和6小时显示适度、时间依赖性细菌负载减少。在3和6小时，非极化组显示与初始细菌负载相比约1.8 log₁₀ CFU/cm²减少。加载Prontosan水凝胶的极化e-bandage在1.5、3和6小时时间点显示细菌负担大幅减少。这些发现表明极化HOCl生成e-bandage与Prontosan水凝胶使用时，导致MRSA生物膜在3小时内减少至低于检测限。极化和非极化组在3和6小时显示与初始量相比更大细菌负载减少。这种快速大幅细菌负载减少凸显了Prontosan水凝胶与极化HOCl生成e-bandage的 additive effect 对MRSA生物膜。

Purilon水凝胶含羧甲基纤维素钠和藻酸钙，设计用于提供湿润伤口愈合环境， intended 用于坏死和 sloughy 伤口、腿溃疡、压力损伤和非感染糖尿病足溃疡等。使用Purilon水凝胶的非极化e-bandage未显示显著细菌减少。使用Purilon水凝胶与极化HOCl生成e-bandage导致细菌负担显著减少，在1.5和3小时观察到显著减少，均减少至低于检测限。这些发现表明6小时极化HOCl生成e-bandage使用Purilon水凝胶对MRSA生物膜具有合适活性。

Skintegrity水凝胶由尿囊素、羟乙基纤维素和右旋糖酐组成。尿囊素有助于保持湿润伤口环境。羟乙基纤维素作为增稠、稳定和乳化剂。右旋糖酐增强保湿性，支持生物相容性，并作为结构支架。如图所示，使用Skintegrity水凝胶的非极化e-bandage组对MRSA生物膜显示抗菌效果，特别是在3和6小时处理时间。此外，使用Skintegrity水凝胶与极化HOCl生成e-bandage导致整个处理持续时间细菌负担大幅、时间依赖性减少。1.5小时处理后发现1.2 log₁₀ CFU/cm²减少，3小时减少4.9 log₁₀ CFU/cm²，6小时减少5.9 log₁₀ CFU/cm²。在6小时处理时间，细菌仍可检测到。这表明尽管Skintegrity水凝胶支持HOCl生成e-bandage功能，但它在6小时处理时间活性 inferior to 3M、Duoderm、Prontosan或Purilon水凝胶。

Solosite是一种水凝胶伤口敷料，含甘油、羧甲基纤维素钠、尿囊素、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。它是一种粘性凝胶， proposed 提供水合并促进伤口自溶清创，包括压力溃疡、腿溃疡和轻微烧伤。使用Solosite水凝胶的非极化e-bandage组在1.5、3和6小时处理期未显示显著抗菌活性。此外，Solosite水凝胶加载极化HOCl生成e-bandage组仅在6小时处理时间点与初始相比经历微生物负载显著减少。结论是Solosite水凝胶不适用于测试的HOCl生成e-bandage。

图3显示了1.77 cm² HOCl生成e-bandage与临床可用水凝胶及黄原胶水凝胶对鲍曼不动杆菌ATCC-17978生物膜在1.5、3和6小时的活性。

在黄原胶水凝胶加载非极化e-bandage组，在任何处理时间（1.5、3和6小时）未观察到对鲍曼不动杆菌的显著抗菌效果。相反，黄原胶加载极化e-bandage组显示显著、时间依赖性细菌负担减少。细菌负载在1.5小时减少5.1 log₁₀ CFU/cm²，3小时减少7.3 log₁₀ CFU/cm²，6小时减少至低于检测限。此外，3和6小时处理显示与1.5小时处理相比更大细菌负载减少。这些发现表明极化HOCl生成e-bandage与黄原胶水凝胶使用时显示大幅和时间依赖性细菌负载减少。

当e-bandage与3M水凝胶配对时，初始和非极化组细菌负担在所有时间点（1.5、3和6小时）保持持续高，表明3M水凝胶 alone 对鲍曼不动杆菌生物膜无抗菌效果。相反，极化HOCl生成e-bandage显示细菌负担显著减少。在1.5小时，极化组显示与初始和非极化组相比6.6 log₁₀ CFU/cm²细菌负载减少。这种减少在3小时更明显（7.2 log₁₀ CFU/cm²细菌负载减少）。6小时极化处理后，菌数减少至低于检测限。这些结果表明3M水凝胶 alone 不影响细菌存活力，其与HOCl生成e-bandage应用导致随时间鲍曼不动杆菌负担大幅减少。

使用Duoderm水凝胶的非极化e-bandage显示与初始组相比对鲍曼不动杆菌生物膜无显著细菌减少。这表明Duoderm水凝胶 alone 在测试条件下对鲍曼不动杆菌生物膜无固有抗菌活性。相反，HOCl生成e-bandage与Duoderm水凝胶配对显示时间依赖性细菌负担减少。在1.5小时，极化组与初始和非极化组相比观察到统计学显著细菌负载减少（5.4 log₁₀ CFU/cm²）。在3小时发现更明显下降，极化处理减少细菌负载7.2 log₁₀ CFU/cm²。6小时处理后，细菌负载减少至低于检测限。3小时HOCl生成e-bandage与Duoderm水凝胶处理比1.5小时处理更 active，6小时处理比1.5和3小时处理更 active。这表明Duoderm水凝胶 alone 不影响细菌存活力，其与HOCl生成e-bandage应用导致随时间鲍曼不动杆菌负担大幅减少。

在Prontosan水凝胶存在下，非极化处理导致鲍曼不动杆菌生物膜在1.5、3和6小时处理时间分别减少1.9、3.1和1.2 log₁₀ CFU/cm²。这表明Prontosan水凝胶本身对鲍曼不动杆菌具有抗菌活性，与MRSA一样。当Prontosan水凝胶与HOCl生成e-bandage使用时，观察到戏剧性且时间依赖性细菌负载减少。在1.5小时，与非极化组相比实现细菌负载减少，四个生物学重复中的三个低于检测限。在3和6小时也观察到减少至低于检测限。这些结果表明Prontosan水凝胶对鲍曼不动杆菌生物膜具有独立抗菌活性，当与HOCl生成e-bandage处理配对时活性更大。

图3E说明了用Purilon水凝胶加载HOCl生成e-bandage处理1.5、3和6小时的鲍曼不动杆菌生物膜细菌负载。在非极化e-bandage组，与初始量相比无显著细菌减少。相反，在极化e-bandage组，观察到随时间显著细菌减少。在1.5小时，极化组显示约4.5 log₁₀ CFU/cm²减少。这种减少在3和6小时更明显，分别减少6.1 CFU/cm²。这些结果表明极化HOCl生成e-bandage与Purilon水凝胶使用时提供有效抗菌活性，导致6小时内完全减少鲍曼不动杆菌生物膜。

在Skintegrity水凝胶加载非极化e-bandage组，对鲍曼不动杆菌生物膜在1.5、3和6小时处理无抗菌效果。然而，极化e-bandage组在所有测试时间点显示显著细菌减少。在1.5和3小时，极化组显示约6.3和5.3 log₁₀ CFU/cm²减少。这种减少在6小时更 substantial，细菌低于检测限。这些结果表明极化HOCl生成e-bandage与Skintegrity水凝胶使用时提供有效抗菌活性。

与Solosite水凝胶配对的非极化e-bandage组在任何处理时间与初始菌数相比无显著抗菌效果。在3和6小时，极化组显示约0.8和3.2 log₁₀ CFU/cm²减少，6小时处理比1.5或3小时处理更 active。这些结果表明Solosite水凝胶与极化HOCl生成e-bandage结合时对鲍曼不动杆菌生物膜显示有限抗菌效果，且这种效果仅在3和6小时处理可观察到。观察到效果不如其他评估水凝胶明显。

图4呈现了加载黄原胶、3M、Duoderm、Prontosan、Purilon、Skintegrity和Solosite水凝胶的e-bandage在1.5 V_Ag/AgCl恒定电位极化 over a 3 h duration 的计时电流数据。具有大多数研究水凝胶的e-bandage通常保持稳定电流响应在 nearly 1 mA；然而，Solosite水凝胶 exhibited 电流值 under 0.4 mA。由于测试水凝胶中唯一变量是化学成分，Solosite水凝胶观察到的阳极电流60%减少可能归因于水凝胶引入的对电化学反应或离子转移的额外阻力。这可能解释Solosite水凝胶与HOCl生成e-bandage配对时抗菌活性减少。

讨论

总体而言，1.77 cm² HOCl生成e-bandage与大多数测试临床可用水凝胶使用时对MRSA和鲍曼不动杆菌生物膜显示活性，Solosite水凝胶活性最差。

6小时处理与HOCl生成e-bandage与3M、Duoderm、Prontosan或Purilon水凝胶显示MRSA生物膜减少至低于检测限。Skintegrity和黄原胶水凝胶加载HOCl生成e-bandage对MRSA生物膜显示比Solosite加载HOCl生成e-bandage更好细菌减少，但Skintegrity水凝胶减少活性 compared to 3M、Duoderm、Prontosan或Purilon水凝胶加载HOCl生成e-bandage。当随时间评估对MRSA生物膜活性时，加载3M、Duoderm和Prontosan水凝胶的极化e-bandage呈现时间依赖性抗菌效果，其中6小时处理比1.5或3小时处理更 active。对于Skintegrity和黄原胶水凝胶，3和6小时处理显示e-bandage活性比1.5小时处理改善。

水凝胶加载HOCl生成e-bandage与3M、Duoderm、Prontosan、Purilon、Skintegrity或黄原胶配对6小时处理显示鲍曼不动杆菌生物膜减少至低于检测限与非极化组相比。Solosite水凝胶加载HOCl生成e-bandage6小时处理后有小但显著细菌减少。对于鲍曼不动杆菌生物膜，Duoderm配对极化e-bandage呈现时间依赖性细菌负载减少，其中3小时处理比1.5小时处理更 active，6小时处理 outperforming 1.5和3小时处理。对于Skintegrity和Solosite，6小时处理比3小时处理更 active，Solosite在6小时与1.5小时相比呈现统计学显著改善。对于黄原胶水凝胶，3和6小时处理都比1.5小时处理更 active。

所有评估水凝胶，除Solosite外，发现可能适用于HOCl生成e-bandage。然而，观察到e-bandage活性变化， likely due to 每种水凝胶物理化学性质差异。例如，基于结果， estimated 当Solosite水凝胶与极化e-bandage使用时需要超过6小时处理以减少整个细菌负载。还注意到Prontosan，但非其他水凝胶（除Skintegrity水凝胶对MRSA生物膜在3小时有小但统计学显著差异外），具有固有抗菌活性；尽管如此，Prontosan水凝胶活性与HOCl生成e-bandage改善。

临床可用水凝胶加载1.77 cm² HOCl生成e-bandage对MRSA和鲍曼不动杆菌的功效与先前使用对照黄原胶水凝胶的研究基本一致， exceptions as noted。需要进一步测试以确认对其他细菌和酵母物种的发现。

致谢

本研究得到国家过敏和传染病研究所支持。内容仅为作者责任，不一定代表NIH官方观点。Dagsuyu博士得到TüB?TAK国际博士后研究奖学金计划支持。