完整基因型HCMV病毒粒蛋白质组学揭示糖蛋白组成调控新机制——gpUL141通过内质网滞留逃避体液免疫

本研究发现人巨细胞病毒（HCMV）编码的gpUL141蛋白不仅作为已知的NK细胞免疫逃逸因子，更通过调控多种病毒包膜糖蛋白复合物（包括三聚体、五聚体及gH/gpUL116复合物）的内质网（ER）滞留，限制其细胞表面表达及病毒粒包装，从而降低合胞体形成、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）及中和抗体敏感性，揭示了一种全新的病毒免疫逃逸双重机制。

　　

人巨细胞病毒（HCMV）是一种具有重要临床意义的β疱疹病毒，其235 kb基因组中相当大比例致力于通过靶向宿主抗病毒蛋白进行降解或重定位来操纵宿主免疫。尽管感染细胞的定量蛋白质组学已广泛表征了这些过程，但细胞外病毒粒的研究相对较少。为此，研究团队对一个临床HCMV毒株（Merlin）的病毒粒进行了蛋白质组学分析。

野生型HCMV病毒粒包含多种传代毒株中缺失的蛋白质

为了确定Merlin毒株病毒粒的完整蛋白质组成，研究使用质谱分析了通过甘油-酒石酸盐梯度分离纯化的病毒粒。分析揭示了96个高置信度的病毒蛋白，其中18个是此前未被描述为病毒粒组分的新蛋白，其中至少10个是膜定位蛋白。与感染细胞裂解物的比较显示，多种病毒粒膜蛋白以及衣壳和皮层蛋白在病毒粒中显著富集。

gpUL141是一种新型病毒粒包膜糖蛋白，但病毒粒递送时不作为免疫逃逸因子

病毒蛋白gpUL141此前被表征为一种有效的NK细胞活化抑制剂。本研究意外地发现gpUL141是病毒粒的一个新组分。Western blot证实了其在纯化病毒粒中的存在，并且定位于病毒粒的包膜区室。有趣的是，病毒粒中的gpUL141对EndoH具有抗性，而细胞内的gpUL141则敏感，表明gpUL141存在两个群体：一个滞留在内质网（ER）内，另一个则必须通过ER和高尔基体运输才能被纳入病毒粒。功能实验表明，病毒粒递送的gpUL141并不影响NK细胞活性，只有细胞内新合成的gpUL141才具备抑制NK活性的功能。

gpUL141在病毒粒内与多种HCMV入侵糖蛋白相互作用

为了探究病毒粒相关gpUL141的功能，研究进行了SILAC免疫共沉淀（SILAC-IP）实验。结果显示，gpUL141与gB、gH、gL、gO和gpUL116存在相互作用。gB是保守的疱疹病毒融合素，gH/gL/gO形成“三聚体”（Trimer）复合物，而gpUL116与gH相互作用但其受体结合功能尚不清楚。进一步的 pairwise 共表达实验表明，只有gH和gB能与gpUL141发生稳健的共免疫沉淀，提示可能是直接相互作用。

gpUL141独立地与所有主要含gH的糖蛋白复合物相互作用

HCMV编码三种含gH的复合物——三聚体（gH/gL/gO）、五聚体（Pentamer, gH/gL/UL128/UL130/UL131A）和UL116复合物（gH/UL116），它们互斥存在。AlphaFold3（AF3）结构预测支持gpUL141二聚体与gH发生高置信度的相互作用，且该结合不会抑制gH与gL或gpUL116的结合。免疫共沉淀实验证实，gpUL141能从感染细胞中拉下gpUL116、gO和UL128，表明其与所有已知的gH-containing复合物都存在相互作用。然而，gpUL141并不连接不同的复合物，其预测的gH结合界面与TRAIL-R2的结合表面显著重叠，并与gH中和抗体13H11的结合位点重叠，提示UL141可能影响抗病毒抗体的表位可用性。

gpUL141调控细胞表面和病毒粒中的gH复合物水平

敲除UL141不影响病毒在成纤维细胞中的细胞外病毒滴度，但能增强在上皮细胞中的病毒滴度和传播。机制研究表明，滞留在ER中的gpUL141会与gH-containing复合物结合，影响其从ER到高尔基体的运输。在上皮细胞和成纤维细胞中，存在gpUL141时，gO的EndoH抗性部分减少，表明更多gO被滞留于ER。流式细胞术和质膜蛋白质组学（Plasma-membrane profiling）分析进一步证实，gpUL141的存在降低了gH、gB、gO、gL、gpUL116和UL128在细胞表面的水平。这一现象在腺病毒载体单独表达糖蛋白的系统中也能重现。相应地，病毒粒中所有这些相互作用蛋白的水平在gpUL141存在时也显著降低。

gpUL141介导的gH复合物水平调控归因于其ER滞留结构域

UL141通过其C末端的经典KKXX模体滞留在ER中。删除此ER滞留结构域（ER-RD）并不影响gpUL141下调细胞表面CD155、CD112或TRAILR2的能力，表明其作为NK细胞免疫逃逸因子的功能不依赖于ER滞留。然而，删除ER-RD后，gO的EndoH抗性形式增加，细胞表面gH和gB的水平也得以恢复，说明ER滞留结构域是gpUL141调控糖蛋白运输的关键。

gpUL141对复合物的细胞内滞留限制了合胞体形成

病毒入侵糖蛋白在感染细胞表面表达后，可与周围细胞上的受体结合导致融合和合胞体形成。研究发现，在ARPE-19上皮细胞中，表达UL141的野生型病毒形成的合胞体数量和大小均显著低于UL141缺失病毒。删除ER-RD则能恢复合胞体形成，表明该现象是由于细胞表面gH复合物运输减少所致，而非gpUL141在细胞表面复合物中的直接存在。

gpUL141介导的gH复合物水平调控抑制体液抗病毒功能

感染细胞表面的病毒抗原是体液免疫的靶点。研究发现，由于ER-RD缺失导致细胞表面抗原运输增加，针对gpUL141本身的抗体所介导的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）显著增强。在病毒生长方面，完全缺失UL141或仅删除其ER-RD都会导致上皮细胞中细胞外病毒滴度升高，但病毒颗粒的感染性（genome:PFU ratio）在野生型病毒中略高。病毒粒纯化表明，缺失UL141导致所有互作蛋白水平升高，而删除ER-RD则部分恢复了某些gH复合物蛋白（如gO）的水平。最重要的是，在低感染复数（MOI）的传播实验中，野生型病毒对多克隆中和抗体制剂（Cytotect）完全抵抗，而UL141缺失病毒则变得敏感。

综上所述，gpUL141不仅通过靶向宿主蛋白（CD155、CD112、TRAILR）来限制NK细胞攻击，还通过其ER滞留结构域改变多种病毒糖蛋白复合物的运输，从而逃避体液免疫。这种对病毒粒包膜和感染细胞表面抗原组成的调控，减少了合胞体形成、降低了ADCC并增强了对中和抗体的抵抗力，代表了一种全新的病毒免疫逃逸策略。该研究强调了在临床前治疗开发过程中，使用编码完整病毒辅助蛋白库的病毒株进行测试的重要性。