纳米尺度免疫突触重组：双特异性衔接器通过共聚集CD16a与NKG2D增强NK细胞功能

本研究揭示双特异性衔接器（CC-96191）通过单分子共连接NK细胞激活受体CD16a与NKG2D，在纳米尺度重构免疫突触，显著增强信号分子（pCD3ζ、pZAP70、pSLP-76）聚集及细胞因子（IFN-γ、TNF-α）分泌，为AML免疫治疗提供新机制视角。

　　

纳米尺度免疫突触重组与NK细胞功能增强机制

Engager Boosts NK Cell Activation Against CD33+ Target Cells

研究通过对比全功能衔接器CC-96191及其变异体（Fc-silent、NKG2D-silent、CD33-silent等），发现CC-96191能显著增强NK细胞对CD33+靶细胞（如EOL-1和CD33转导的Raji细胞）的活化。全功能衔接器诱导CD69表达上调，促进IFN-γ和TNF-α分泌（分别提高4倍和3.5倍），并增强脱颗粒标志物CD107a的表达（26% vs. 13%）。细胞毒性实验表明，CC-96191对靶细胞的特异性杀伤率（49.6%）显著高于双变异体组合（39%）。这些功能优势表明，单分子共连接CD16a与NKG2D比分离分子策略更有效。

Superresolution Microscopy Reveals Synaptic Nanoclusters of CD16a and NKG2D

利用平面脂质双层（PLB）模型和直接随机光学重建显微镜（dSTORM），研究团队发现CC-96191能诱导CD16a与NKG2D在免疫突触处形成高密度纳米簇。全功能衔接器处理组的CD16a定位密度达750±287 localizations/μm2，NKG2D达1,350±580 localizations/μm2，显著高于各沉默变异体。纳米簇面积分析显示，CC-96191组CD16a和NKG2D簇面积分别为22,100±8,400 nm2和21,800±7,100 nm2，远超单受体连接条件。Ripley’s H函数分析进一步证实衔接器促进受体簇的富集与生长。

Engager Promotes the Coalescence of CD16a and NKG2D Nanoclusters

通过双色dSTORM与坐标共定位分析（CBC），研究发现CC-96191驱动CD16a与NKG2D纳米簇紧密共定位（28%局部化点评分＞0.5），而分离分子策略仅达13%。最近邻距离（NND）分析显示，全功能衔接器组CD16a与NKG2D簇间距为38±15 nm，而双变异体组合为100±44 nm。对照实验（如非互作受体NKp46/CD94）证实纳米簇共定位的特异性。这表明单分子衔接器通过空间逼近机制促进受体协同。

Coligation of CD16a and NKG2D Promotes the Recruitment and Coalescence of pCD3ζ and pZAP70

下游信号分子分析显示，CC-96191增强CD3ζ（ITAM基序）和ZAP70的磷酸化与共聚集。pCD3ζ定位密度在全功能衔接器组达2,000±1,000 localizations/μm2，pZAP70达1,100±900 localizations/μm2，且纳米簇面积更大（pCD3ζ: 19,300±6,300 nm2；pZAP70: 12,100±2,800 nm2）。CBC分析表明pCD3ζ与pZAP70的共定位评分显著升高（27%），NND缩短至51±15 nm。这表明受体共聚集通过拉近信号蛋白距离放大激活信号。

Engager Enhances Downstream Signaling

关键适配蛋白SLP-76的磷酸化纳米簇在CC-96191处理下密度（270±145 localizations/μm2）和面积（18,900±6,900 nm2）均显著增加，且与NKG2D共定位程度高（24%评分＞0.5，NND=50±40 nm）。对比单一受体连接，衔接器通过协同信号轴（DAP10-PI3K-LAT/SLP-76与ITAM通路）整合，提升信号导效率。

Engager Augments NK Cell Activity Against AML blasts

在复杂细胞环境（如PBMCs）中，CC-96191仍能有效激活健康供体及AML患者NK细胞，诱导IFN-γ和TNF-α分泌。患者来源NK细胞（CD33+ blast占比40–70%）中，衔接器显著增强受体共定位（CBC评分26%）与纳米簇形成。但新鲜分离未预激的NK细胞反应较弱，提示细胞因子预激（如IL-2）对功能输出至关重要。

Discussion

研究揭示双特异性衔接器通过纳米尺度空间重构放大NK细胞激活信号的机制：单分子共连接促使CD16a与NKG2D形成紧密纳米簇，富集下游信号分子（pCD3ζ、pZAP70、pSLP-76），协同ITAM与DAP10通路。该发现为设计新一代免疫衔接器提供了纳米尺度优化方向（如调控结合域间距），并拓展至其他受体组合的协同效应研究。