黏着斑激酶抑制通过RhoA/肌动蛋白通路调控水通道蛋白2膜聚集的新机制及其在肾脏水代谢疾病中的潜在治疗意义

本研究发现黏着斑激酶（FAK）抑制剂VS-4718通过抑制RhoA活性和诱导肌动蛋白解聚，显著促进肾脏上皮细胞中水通道蛋白2（AQP2）的膜聚集。该过程不依赖cAMP/PKA信号通路及AQP2 S256位点磷酸化，但涉及S269磷酸化与S261去磷酸化修饰。研究揭示了FAK-RhoA-肌动蛋白轴作为调控AQP2膜转运的全新路径，为肾病性尿崩症等水盐平衡紊乱疾病提供了潜在治疗靶点。

　　

引言

水通道蛋白2（AQP2）在肾脏集合管主细胞（PCs）中表达，对抗利尿激素血管加压素（VP）响应过程中起核心作用。VP通过V2受体（V2R）激活cAMP/PKA信号通路，促使AQP2羧基末端丝氨酸残基磷酸化（主要为S256），进而介导其从胞内囊泡向顶膜转运，增强水的重吸收能力。除经典cAMP依赖途径外，微管和肌动蛋白细胞骨架也参与调控AQP2的动态循环。近期研究表明，黏着斑激酶（FAK）作为非受体酪氨酸激酶，通过调节小GTP酶（如RhoA）和肌动蛋白细胞骨架动力学，影响多种细胞过程包括内吞、外排及囊泡运输。然而，FAK是否参与AQP2膜转运调控尚未明确。

材料与方法

研究采用稳定表达野生型或S256A突变型AQP2的LLC-PK1细胞系（LLC-AQP2）及大鼠肾脏组织切片模型。通过免疫荧光染色、细胞表面生物素化、内吞（罗丹明标记转铁蛋白摄取）与外排（分泌型YFP荧光测定）实验分析AQP2膜定位变化。使用FAK特异性抑制剂VS-4718（1 μM）处理细胞，并以血管加压素（LVP/AVP）作为阳性对照。Western blot检测磷酸化FAK（Tyr397）、AQP2磷酸化位点（S256、S261、S269）、RhoA活性及Src磷酸化水平。肌动蛋白聚合状态通过罗丹明-鬼笔环肽结合实验定量，细胞内cAMP浓度采用ELISA法测定。

结果

FAK抑制诱导培养细胞中AQP2膜聚集

VS-4718处理30分钟后，LLC-AQP2细胞呈现显著的AQP2膜聚集现象，效果与LVP处理相似。细胞表面生物素化实验证实膜结合AQP2蛋白量增加约2倍（P < 0.0001），且呈剂量依赖性。

FAK抑制减少AQP2内吞并促进外排

罗丹明-转铁蛋白内吞实验显示，VS-4718处理显著抑制网格蛋白介导的内吞作用，效果与甲基-β-环糊精（MβCD）相当。低温阻断实验进一步表明，VS-4718延迟AQP2核周斑块形成，提示内吞速率降低。同时，分泌型YFP外排实验证实VS-4718可增强囊泡外排速率约20%，表明FAK抑制通过双向调节内吞/外排平衡促进AQP2膜积聚。

FAK调控通路独立于cAMP及S256磷酸化

VS-4718处理未引起细胞内cAMP浓度或CREB磷酸化水平升高，且对表达S256A突变体的细胞仍能诱导AQP2膜聚集。Western blot分析显示，VS-4718不改变S256磷酸化状态，但显著增强S269磷酸化并降低S261磷酸化，该修饰模式与VP效应一致。

FAK抑制通过RhoA/肌动蛋白通路发挥作用

VS-4718处理导致RhoA活性显著降低，并引起F-肌动蛋白解聚（减少10%–15%），效果与VP及肌动蛋白解聚剂latrunculin A类似。免疫荧光虽未显示明显肌动蛋白结构重构，但生化数据支持肌动蛋白动力学改变参与FAK调控的AQP2转运。

肾脏组织中原位验证FAK调控效应

大鼠肾脏切片实验表明，VS-4718处理可诱导集合管主细胞顶膜及基底侧膜AQP2聚集，分布模式与AVP处理一致。值得注意的是，内髓质主细胞中AQP2在基底侧膜的积累更为显著，反映肾脏不同区段细胞极性调控的差异性。

VP与FAK抑制剂的磷酸化FAK调控差异

VS-4718处理显著降低磷酸化FAK（Tyr397）及磷酸化Src（Tyr416）水平。相反，AVP虽未改变总p-FAK含量，但诱导其从基底侧向顶膜区重分布，提示VP可能通过空间调控FAK活性而非总量变化影响AQP2转运。

讨论

本研究首次揭示FAK-RhoA-肌动蛋白轴作为调控AQP2膜转运的新型通路。FAK抑制通过降低RhoA活性、诱导肌动蛋白解聚，双向调节内吞抑制与外排促进，最终导致AQP2膜积聚。该过程独立于经典cAMP/PKA信号，但涉及S269磷酸化（可能增强膜稳定性）及S261去磷酸化修饰。值得注意的是，FAK抑制剂在肾脏不同区段主细胞中重现了VP诱导的AQP2极性分布特征，提示其调控机制具有生理相关性。

与既往研究相比，FAK调控通路与Src抑制（如dasatinib）效应部分重叠但存在差异：两者均抑制内吞且诱导S269磷酸化，但仅FAK抑制引起S261去磷酸化。此外，肾脏组织中FAK与Src活性协同下调，而培养细胞中Src磷酸化未受显著影响，提示体内外模型信号网络存在语境依赖性差异。

数据可用性

数据可根据合理要求提供。

补充材料

补充图S1–S3及抗体列表详见FigShare数据库（DOI: 10.6084/m9.figshare.29621051等）。

资助声明

本研究受美国国立卫生研究院（NIH）基金DK096915、DK096586-10A1等资助，并获哈佛肾脏病学培训计划（HKUHTI）支持。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

作者贡献

A.T.-M.、J.H.等设计并执行实验，D.B.与H.A.J.L.共同指导研究。所有作者参与数据解读及论文修订。