不同含量瘦牛肉对地中海饮食模式下肠道菌群及代谢产物的影响：一项随机交叉对照喂养试验

本研究发现，在地中海饮食模式（MED）中加入适量瘦牛肉（≤71克/天/2000千卡）可增加肠道菌群多样性并降低血浆和尿液中氧化三甲胺（TMAO）浓度，且不会使TMAO水平超过心血管疾病（CVD）风险阈值。该研究通过随机交叉对照试验证实，健康饮食模式可调节TMAO代谢，为合理摄入红肉提供了科学依据。

　　

Abstract

Background

食用含有瘦牛肉中肉碱等氧化三甲胺（TMAO）前体物质会升高循环TMAO浓度，但健康饮食模式可能减弱这种效应。

Methods

这项随机、4周期交叉、对照喂养研究调查了地中海风格（MED）饮食（碳水化合物42%、蛋白质17%、脂肪41%）分别包含14（MED0.5；0.5盎司）、71（MED2.5；2.5盎司）和156（MED5.5；5.5盎司）克/天/2000千卡瘦牛肉，与平均美国饮食（AAD；碳水化合物52%、蛋白质15%、脂肪33%；71克/天/2000千卡牛肉）相比，对肠道菌群组成以及血浆、尿液和粪便代谢物（包括TMAO及其前体分子）的影响。30名基本健康的个体每种饮食食用4周，期间有≥1周的洗脱期。在基线和每个4周饮食期结束时收集空腹血样、24小时尿样和粪便样本。代谢物通过质子核磁共振（¹H NMR）和液相色谱/质谱（LC/MS）测量。肠道菌群组成通过16S rRNA基因的扩增子测序测量。

Results

三种MED饮食与AAD相比增加了肠道菌群多样性。与MED0.5（平均倍数差异1.78 [95% CI, 1.05–3.06]）和MED2.5（2.04 [95% CI, 1.18–3.52]）相比，AAD后的血浆TMAO更高。与MED0.5（1.88 [95% CI, 1.19–2.97]）、MED2.5（2.15 [95% CI, 1.37–3.39]）和MED5.5（1.76 [95% CI, 1.12–2.77]）相比，AAD后的尿液TMAO更高。

Conclusions

与AAD相比，在地中海风格饮食中包含高达71克/天的瘦牛肉增加了健康成年人的肠道菌群多样性并降低了TMAO浓度。

REGISTRATION

URL: https://clinicaltrials.gov; Unique identifier: NCT02723617.

Nonstandard Abbreviations and Acronyms

¹H NMR: 质子核磁共振

AAD: 平均美国饮食，含71克（2.5盎司）瘦牛肉/天/2000千卡

ASV: 扩增子序列变体

LC/MS: 液相色谱/质谱

MED: 地中海风格

MED0.5: 地中海风格饮食，含14克（0.5盎司）瘦牛肉/天/2000千卡

MED2.5: 地中海风格饮食，含71克（2.5盎司）瘦牛肉/天/2000千卡

MED5.5: 地中海风格饮食，含156克（5.5盎司）牛肉/天/2000千卡

PERMANOVA: 置换多元方差分析

PLS-DA: 偏最小二乘判别分析

TMA: 三甲胺

TMAO: 氧化三甲胺

Clinical Perspective

What Is New?

• 在一项对照喂养试验中，与含有71克/天/2000千卡牛肉的平均美国饮食相比，含有14和71克/天/2000千卡瘦牛肉的地中海风格饮食降低了血浆和尿液氧化三甲胺（TMAO）浓度；然而，所有饮食后的血浆TMAO浓度仍远低于增加心血管疾病风险的临床阈值。

• 地中海风格饮食后肠道菌群多样性增加，且不受牛肉剂量的影响，而无论饮食如何，都观察到TMAO浓度存在显著的个体间差异。

What Are the Clinical Implications?

• 在健康个体中，作为地中海风格饮食的一部分，适量摄入瘦牛肉不会将氧化三甲胺（TMAO）升高到被认为与心血管疾病风险临床相关的浓度。

流行病学证据表明，较高的红肉摄入量与心血管疾病（CVD）风险增加相关。然而，由于残留混杂因素和常用自我报告饮食评估方法固有的测量误差，从观察数据建立因果关系具有挑战性。临床试验证据表明，瘦的、未加工的红肉可以作为心脏健康饮食模式的一部分，而不会对传统CVD风险因素产生不利影响。尽管如此，对于新型CVD风险因子氧化三甲胺（TMAO）仍存在担忧，TMAO是在动物性食物代谢过程中产生的，并与动脉粥样硬化斑块形成有关。虽然牛肉摄入与TMAO产量增加之间存在关联已被记录，但将牛肉消费的具体效应与整体饮食模式的效应分离开来仍然很困难。只有一项临床试验研究了高牛肉心脏健康饮食模式对TMAO的反应，该研究表明，与较低剂量（200克/周；~7盎司-当量/周）相比，含有较高剂量红肉（500克/周；~18盎司-当量/周）的地中海风格（MED）饮食增加了循环TMAO。在美国膳食指南框架内，2000千卡饮食中肉类、禽类和鸡蛋的推荐摄入量为每周26盎司-当量。需要进一步的研究来阐明不同水平的牛肉消费如何影响心脏健康饮食模式中的TMAO生产，以及当牛肉摄入量保持不变时，健康与不健康饮食模式对TMAO的影响有何不同。

TMAO是膳食胆碱、肉碱、甜菜碱和富含磷脂酰胆碱的动物性食物（如红肉、鸡蛋、鱼和禽类）的肠道菌群依赖性代谢产物。这些前体分子被肠道菌群代谢成三甲胺（TMA），随后在肝脏中被氧化成TMAO。动物实验和体外研究表明，TMAO通过促进泡沫细胞形成、血管炎症、内皮功能障碍和减少胆固醇逆向转运来促进动脉粥样硬化性CVD。与此一致，前瞻性队列研究显示较高的血浆TMAO浓度与较高的动脉粥样硬化性CVD事件和死亡率风险相关。然而，饮食质量可能改变TMAO与CVD风险之间的关联。护士健康研究队列的一项前瞻性巢式病例对照分析表明，高饮食质量减弱了TMAO与冠心病风险之间的关联，而低饮食质量则加强了该关联。在该分析中，饮食质量评分通常随着动物产品摄入量的降低而更高；因此，含有动物产品的更高质量饮食的心血管影响仍不清楚。此外，在应对膳食前体时，观察到血浆TMAO浓度存在巨大的个体间差异。这种变异性部分由肠道菌群介导，因为三甲胺的生产依赖于微生物的作用，而这些微生物的类型和数量可能因整体饮食模式而改变。一项横断面国际汇总分析（n=32 166）表明，健康饮食模式的典型膳食成分，如坚果和植物蛋白，与循环TMAO呈负相关，这可能是因为对肠道微生物组的调节。

本文介绍了一项对照喂养、随机交叉试验的事后探索性分析，该试验评估了含有0.5（MED0.5）、2.5（MED2.5）或5.5（MED5.5）盎司/天/2000千卡瘦牛肉的地中海饮食与含有2.5盎司/天/2000千卡牛肉的平均美国饮食（AAD）相比的效果。该试验的主要发现表明，≤2.5盎司/天/2000千卡的瘦牛肉可以作为健康MED饮食模式的一部分，而不会损害其对脂质和脂蛋白的有益影响。本探索性分析旨在检查在健康MED饮食中消耗不同量的瘦牛肉（14, 71, 156克/天/2000千卡 [0.5, 2.5, 5.5盎司/天/2000千卡]）对肠道菌群以及血浆、尿液和粪便代谢物的影响，并与含有71克（2.5盎司）牛肉/天/2000千卡的AAD进行比较。假设MED饮食与AAD相比会增加微生物多样性。此外，假设由于整体健康饮食模式引起的肠道菌群组成变化，MED饮食后的TMAO浓度会低于AAD。这项研究将有助于理解与饮食相关的TMAO调节以及肠道菌群组成对TMAO生产中个体间变异性的影响。

METHODS

Study Design

文章中描述的数据、代码簿和分析代码将在请求并经通讯作者批准后提供。预设主要和次要结果的方法和结果的完整描述已先前发表。简而言之，在宾夕法尼亚州立大学和美国农业部贝尔茨维尔人类营养研究中心进行了一项4周期、随机、交叉、对照喂养研究。样本量60名参与者（每个地点n=30）是基于低密度脂蛋白胆固醇（预设主要结果）确定的。本文中呈现的分析仅使用了宾夕法尼亚州立大学地点的样本（n=30）。使用16S rRNA基因测序分析粪便微生物群。首先使用质子核磁共振（¹H NMR）分析血浆、尿液和粪便代谢物。由于大多数样品中浓度低（<3 μM），使用¹H NMR未检测到血浆样品中的TMAO及相关前体分子。因此，改用液相色谱/质谱（LC/MS）分析血浆样品，这样可以检测到更低的浓度。使用非靶向和靶向LC/MS分别获得TMAO相关代谢物的相对和绝对浓度。对于所有分析，在基线和每个4周饮食期结束时收集样本。宾夕法尼亚州立大学的机构审查委员会在研究开始前批准了研究方案。该试验在ClinicalTrials.gov注册为NCT02723617。

父研究包括4种干预饮食：（1）包含14克（0.5盎司）瘦牛肉/天/2000千卡的MED饮食（MED0.5），（2）包含71克（2.5盎司）瘦牛肉/天/2000千卡的MED饮食（MED2.5），（3）包含156克（5.5盎司）瘦牛肉/天/2000千卡的MED饮食（MED5.5），（4）包含71克（2.5盎司）牛肉/天/2000千卡的AAD。这些受控的、维持体重的饮食具有固定的宏量营养素组成，仅在MED饮食（41%脂肪、42%碳水化合物、17%蛋白质）和AAD（33%脂肪、52%碳水化合物、15%蛋白质）之间有所不同。本研究中使用的瘦牛肉由美国农业部定义为<10克脂肪、<4.5克饱和脂肪和<95毫克胆固醇每100克。饮食中的酸奶含量也不同，MED饮食包含希腊酸奶（Chobani），而AAD包含传统酸奶（Dannon）；这些酸奶的微生物组成不同。参与者接受每种饮食4周，饮食周期之间至少有1周的洗脱期。研究饮食在现场的代谢厨房设施中制备，包括在整个4周干预期内每天提供3餐和2份零食，使用7天轮换菜单。使用FOOD PROCESSOR（ESHA Research）开发菜单，并分析饮食的营养成分以验证宏量营养素组成并确保方案准确性。简而言之，对两个热量水平下每个菜单的均质样品由Covance Laboratories, Inc.进行分析。测试饮食营养成分的化学分析呈现在表1中。

Research Participants

参与者是不吸烟的个体，体重指数20至40 kg/m²，年龄30至70岁，在2016年10月至2017年11月期间从州学院（宾夕法尼亚州）地区招募。所有参与者在筛选和入组前提供了书面知情同意。排除标准包括甘油三酯>350 mg/dL；高密度脂蛋白胆固醇<美国人口的第15百分位数（男性<37 mg dl，女性<47 mg dl）；低密度脂蛋白胆固醇>190 mg/dL；空腹血糖>126 mg/dL；血压>160/100 mm Hg；或有肾脏疾病、肝脏疾病、痛风、未治疗或不稳定的甲状腺功能亢进或减退、癌症、胃肠道疾病、胰腺疾病、其他代谢疾病、吸收不良综合征或CVD病史。使用降胆固醇药物或拒绝停止摄入推定的降胆固醇补充剂（欧车前、鱼油胶囊、大豆卵磷脂、烟酸、纤维、亚麻和植物雌激素）也是排除标准。为了符合资格，需要在研究入组前根据补充剂类型停止服用2至4周。服用降压药的个体如果其筛查血压<160/100 mm Hg则符合资格。参与者的饮食依从性很高（>90%），如先前报道。

Sample Collection

在基线（第1阶段开始）和每个饮食期结束时，在诊所连续两天收集血样。指示参与者在每次收集前48小时避免饮酒和使用抗炎药物。要求参与者在每次收集前24小时不进行剧烈运动，并在就诊前12小时不进食任何食物或饮料（水除外）。将EDTA血浆样品分装并存储在-80°C直至分析。对于这些分析，使用了每个时间点一天收集的样品。参与者在基线和每个饮食期结束时在家收集粪便样本。向参与者提供粪便样本收集套件，包括一个30 mL Para-Pak Clean Vial（Meridian Bioscience, Cincinnati, OH）、一个粪便收集帽、一个长柄勺、一个冷却器、自封袋、冰袋和非乳胶手套。指示参与者将样本存放在冷冻室中，并在第二天用放有冰袋的冷却器返回。粪便样本存储并保持冷冻在-80°C直至分析。收集的粪便样本未添加防腐剂。参与者在基线和每个饮食期结束时在家收集24小时尿液样本。向参与者提供24小时尿液收集套件和详细的收集说明。指示参与者从第1天诊所访问后立即开始收集所有尿液，直至第2天诊所访问。尿液收集容器放在带有冰袋的冷却器中提供。收集的尿液样本未添加防腐剂。将样品分装并存储在-80°C直至分析。

Microbiota Analysis

使用ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA Kit（Zymo D4308）根据制造商方案从粪便等分试样中提取DNA。根据完善的扩增子文库制备方案（https://github.com/BisanzLab/AmpliconSeq），使用引物515F（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）和806R（GGACTACNVGGGTWTCTAAT）以及用于i7和i5适配器的部分重叠序列对样品进行扩增，靶向16S rRNA基因的V4区。使用一系列10倍稀释来获得指数增长后期的扩增用于索引。所有聚合酶链反应（PCR）均使用KAPA HiFi hot start酶进行。通过稀释产物并使用独特的正向和反向条形码（12nt）进行有限扩增来进行索引PCR。通过Pico-green染料（Life Technologies）确定索引产物的浓度后，在通过Ampure XP珠子进行大小选择之前，将样品以等摩尔比例混合。将混合的文库在宾夕法尼亚州立大学基因组学核心设施中使用MiSeq V3 600循环试剂在一批中测序。使用QIIME2 v2023.5和Dada2 v1.26.0分别对数据进行解复用和去噪。基于SILVA 138数据库通过Qiime2分类器进行99%相似性聚类的 taxonomy 分配，随后使用Qiime2 phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree流程建立系统发育树。阴性对照包括未能产生产物的提取空白，但仍以最大可用反应体积混合。这些空白包含<300个读长，而所有样品中的读长数量>10,000。因此，所有样品都包含用于alpha多样性、beta多样性和差异丰度分析。

使用观察到的扩增子序列变体（ASVs）（picante v1.8.284）、香农多样性（vegan v2.6-6.1）和系统发育多样性（picante v1.8.284）指标评估alpha多样性。使用Bray-Curtis（vegan v2.6-6.1）、中心对数比（CLR）欧几里得距离（即Aitchison距离，使用qiime2R v0.99.685中的make_clr函数）、Jensen-Shannon散度（phyloseq_1.44.0）、系统发育等距对数比欧几里得距离（philr v1.26.0）、加权UniFrac（rbiom v1.0.3中的unifrac函数）和非加权UniFrac（rbiom v1.0.3中的unifrac函数）指标估计beta多样性。测序数据可在国家生物技术信息中心序列读存档下获取，登录号为PRJNA1199414。使用系统发育调查通过重建未观察状态（PICRUSt2）v 2.4.2推断肠道微生物群的功能潜力。基于16S rRNA ASV丰度生成预测的宏基因组，功能注释分配给京都基因和基因组百科全书（KEGG） Orthology 基因家族和代谢途径。

Metabolomics Analysis

首先使用¹H NMR代谢组学对尿液、粪便和血浆样品中的非靶向代谢物进行定量，遵循先前描述的方法并进行修改。此处不描述血浆¹H NMR样品制备，因为不呈现血浆¹H NMR样品的结果。相反，由于LC/MS具有卓越的检测限，将其用于血浆分析。约50 mg湿粪便样品使用1.2 mL PBS（0.1 M, 50% D₂O, pH 7.4）提取，其中含有0.005% (w/v) TSP作为内标。经过匀浆、冻融和离心步骤后，将550 μL上清液转移至5 mm ¹H NMR管中进行¹H NMR分析。然后将500 μL尿液样品与14 μL KF（5 M）在1.7 mL EP管中混合，涡旋和离心后，将450 μL上清液转移至预先加入EDTA-d12的5 mm ¹H NMR管中。加入45 μL PBS（1.5 M, 100% D2O）和0.01% (w/v) TSP作为内标后，样品用于¹H NMR分析。提取物的¹H谱在298 K下使用Bruker Avance NEO 600 MHz光谱仪采集，配备SampleJet样品转换器（Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany），一批完成。使用noesygppr1d脉冲序列记录¹H一维NMR实验，在弛豫和混合时间内进行预饱和水抑制。所有¹H NMR光谱使用Chenomx NMR Suite（Chenomx Inc, Edmonton, Alberta, Canada, version 10）自动处理，然后手动检查和调整每个光谱的相位和基线。使用Chenomx软件内置的代谢物库和拟合算法，与内标（TSP）的浓度进行比较，来识别和定量代谢物。

通过将血浆样品用含有1 μM氯丙胺的冰冷甲醇按1:3稀释来制备LC/MS样品，随后进行涡旋，在-20°C孵育1小时，并在4°C下以14,000 g离心15分钟。将上清液转移至LC进样瓶进行分析。对于非靶向代谢物分析，样品在Nexera 40高效液相色谱系统（Shimadzu）上进行分析，该系统与ZenoTOF 7600质谱仪（Sciex）耦合，一批完成，采用正离子模式的电喷雾离子源。色谱分离在Waters Acquity BEH C18柱（2.1 × 150 mm, 1.7 μm）上于45°C进行，流动相流速为0.35 mL/min。流动相由含0.1%甲酸的水（溶剂A）和含0.1%甲酸的乙腈（溶剂B）组成，梯度程序为：0至1分钟，0% B；10至15分钟，90% B；16至20分钟，0% B。样品进样体积为5 μL。在50至1000 m/z范围内采集MS1数据，累积时间为50毫秒，并在HRMRM模式下收集胆碱、甜菜碱、肉碱、三甲胺和TMAO的MS2数据，使用30至40 eV的碰撞能量和每个化合物的特定m/z范围。使用MS-DIAL（v5.1）基于内部和公共参考库进行特征识别。对于靶向代谢物定量，样品在相同的高效液相色谱系统上进行分析，该系统与QTrap 6500+质谱仪（Sciex）耦合，一批完成，色谱分离参数类似，但流速为0.30 mL/min。在多反应监测（MRM）模式下采集MS数据，使用以下跃迁：104.1→60.1（胆碱）、118.1→59.1（甜菜碱）、162.1→103.1（L-肉碱）、151.1→58.1（TMAO）和277.04→192.1（氯丙胺）。去簇电压设置为60 V，离子喷雾电压为5500 V，气帘气为35 psi，雾化气为50 psi，加热气为70 psi，加热器温度为600°C。使用Sciex OS软件进行定量。低于检测下限（0.1 μM）的TMAO值根据EPA（美国环境保护署）指南设定为0.05 μM，因为低于此阈值的样品少于15%。靶向和非靶向样品均重复分析两次，最终值取平均。

Statistical Analysis

使用R（v 4.4.0）进行统计分析，主要使用vegan v2.6-6.1、Qiime2 v2023.5、lme4 v1.1.35.4、lmertest v3.1.3和emmeans v1.10.2包。

Microbiota Data

通过检查缺失值、执行必要的清理和标准化数据以用于统计模型来准备微生物群数据。对于alpha多样性计算以及Bray-Curtis和UniFrac距离计算，通过有放回的子抽样将数据稀疏化到具有最低读长数的样本的测序深度。对于差异丰度分析，使用计数零乘性零替换方法对微生物群数据进行CLR转换。拟合线性混合效应模型以评估饮食对alpha多样性、beta多样性指数和单个微生物差异丰度的影响，调整阶段、基线值和性别；使用III型ANOVA F检验评估饮食效应的显著性。目视检查所有线性模型输出以确保线性、方差齐性和残差正态性的假设得到满足。为了进一步评估线性混合模型假设，使用置换检验进行了敏感性分析。将具有显著饮食效应的模型进行置换检验，其中在排除协变量的简化模型内对饮食进行1000次置换。使用Phipson和Smyth校正从得到的F统计量零分布计算经验P值。所有置换检验得出的经验P值均<0.05，表明观察到的饮食效应不太可能是偶然产生的，并支持了研究结果的可靠性。Alpha多样性模型和差异丰度模型针对阶段、基线值和性别进行了调整；beta多样性从基线变化模型针对阶段和性别进行了调整。通过在alpha和beta多样性模型中添加一个携带变量并检查主效应P值<0.05来测试一阶携带效应；由于未观察到显著的携带效应，最终模型中未包含携带。在所有模型中，饮食作为固定效应，参与者作为随机效应。测试了性别与饮食的交互作用以评估饮食反应的性别差异。

对于差异丰度分析，使用Benjamini-Hochberg程序对饮食主效应P值进行多重比较校正，错误发现率（FDR）阈值<0.1视为显著。对于alpha和beta多样性指数，使用alpha为0.05认为饮食主效应显著。当在任何模型中检测到饮食主效应时，进行事后配对检验，并使用Tukey-Kramer方法对多重比较进行调整，alpha为0.05视为显著。从线性混合效应模型计算最小二乘均值、标准误和饮食间差异及95% CI。为了评估微生物群组成变化的方向性，使用CLR欧几里得距离矩阵计算每种饮食从基线起的主坐标1（PC1）变化。使用pcoa（ape v5.8-1）在完整的CLR欧几里得距离矩阵上进行主坐标分析，将所有样本嵌入共享的排序空间。提取PC1值，并在每个受试者内，从每种饮食条件的PC1值中减去基线PC1值。敏感性分析测试了在排除这些微生物后重新计算多样性指数并与完整数据集进行比较时，具有显著差异丰度的特定酸奶益生菌微生物的影响。

Metabolomics Data

首先清理代谢组学数据并评估缺失值。目视评估代谢物浓度的分布是否存在偏斜，这在代谢组学数据集中很常见。为了减少偏斜并提高模型性能，使用自然对数（log）或平方根变换对代谢物值进行适当转换。对于对数变换，添加一个等于该代谢物最小非零值的小常数以适应零值。所有代谢物浓度在分析后反变换回原始尺度。通过将代谢物浓度除以每个样品中的肌酐浓度，在对数变换前对尿液代谢物进行肌酐浓度归一化以考虑水含量。拟合线性混合效应模型以评估饮食对血浆、粪便和尿液代谢物的影响，调整阶段、基线值和性别；使用III型ANOVA F检验评估饮食效应的显著性。如微生物群数据所述评估模型假设、性别与饮食交互作用以及携带效应。在所有模型中，饮食作为固定效应，参与者作为随机效应。对于整个代谢物数据集的探索性分析，使用Benjamini-Hochberg程序对饮食主效应P值进行多重比较校正，FDR阈值<0.1视为显著。对于靶向TMAO相关代谢物，饮食主效应在P<0.05时视为显著。当在任何模型中检测到饮食主效应时，进行事后配对检验，并使用Tukey-Kramer方法对多重比较进行校正，alpha为0.05。对于对数变换的代谢物，报告饮食间的倍数差异，以准确反映反变换前对数变换尺度中的乘法关系。

Microbiota and Metabolomics Profiles

为了评估饮食间代谢组学和微生物群谱的整体差异，使用vegdist（vegan v2.6-6.1）计算样本的欧几里得距离。使用adonis2（vegan v2.6-6.1）对肠道微生物群以及血浆、尿液和粪便代谢物的距离矩阵进行置换多元方差分析（PERMANOVA），以饮食为主要因素。通过在模型中包含参与者并按参与者分层置换来调整受试者内变异性。使用999次置换和alpha为0.05评估饮食效应的显著性。为了可视化，使用plsda（mixOmics v6.28）对原始数据进行多水平偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。调整多水平PLS-DDA模型以考虑受试者内变异性。生成PLS-DA得分图，椭圆代表每个饮食组（包括基线）的95% CI。

Within-Diet Variability and TMAO Prediction

使用betadisper（vegan v2.6.6.1）评估饮食（包括基线和4个饮食期）对微生物群落结构和代谢组学谱变异性（离散度）的影响。使用置换检验评估多元离散度的同质性，使用permutest（ve