α-番茄碱通过抑制Wnt/β-catenin信号与RelB介导的耐药性在肝细胞癌治疗中的双重机制研究

本研究发现植物源生物碱α-tomatine通过抑制Wnt/β-catenin信号通路（β-catenin磷酸化/降解）发挥抗肝细胞癌（HCC）作用，但同时诱导RelB介导的耐药性。研究通过CRISPR/Cas9基因编辑、动物模型及多组学分析证实，联合靶向RelB可显著增强α-tomatine疗效，为植物药理学与精准肿瘤学协同治疗HCC提供了新范式。

　　

α-番茄碱通过G2/M期阻滞抑制肝细胞癌增殖与迁移

研究显示，番茄源甾体生物碱α-番茄碱（α-tomatine）由糖基（番茄碱）和四糖基（β-四葡萄糖）构成，其分支结构附着于糖的C-3位点。通过MTT实验发现，α-番茄碱以剂量依赖方式（0.2-5.0 μM）显著抑制HepG2细胞生长，24小时EC₅₀值为0.5418 ± 0.077 μM。伤口愈合实验和Transwell侵袭实验表明，2 μM α-番茄碱处理12小时后可明显抑制细胞迁移和侵袭能力。流式细胞术检测显示，药物处理导致G2/M期细胞群体显著增加。Western blot分析进一步揭示，α-番茄碱下调细胞周期调控蛋白Cyclin A和Cyclin B1的表达，而不影响p27蛋白水平，表明其诱导G2/M期阻滞的作用不依赖p27通路。

转录组学分析揭示多通路调控网络

RNA测序结果显示，α-番茄碱处理12小时和24小时后，共鉴定出375个差异表达基因（DEGs），其中247个基因表达下调，128个基因表达上调。基因本体（GO）分析表明，下调基因富集于RNA代谢过程、细胞外基质结合、RNA聚合酶II转录调控等生物学过程；而上调基因主要涉及细胞因子反应、炎症反应、防御反应和凋亡过程。IPA通路分析发现，WNT反应、细胞外基质组织、NOTCH信号、5-HT受体信号和KEAP1-NFE2L2通路活性受到抑制，而激活素-抑制素信号、炎症反应通路、IL17信号和HMGB1信号则被激活。

Wnt/β-catenin信号通路介导抗肿瘤效应

机制研究表明，α-番茄碱时间依赖性降低Axin2和β-catenin蛋白表达水平。Super8XTOPFlash荧光素酶报告实验证实，药物处理12小时和24小时后Wnt/β-catenin信号活性显著降低。功能实验发现，Wnt通路激动剂Wnt3a处理可挽救α-番茄碱诱导的细胞活力抑制，而抑制剂XAV939则增强其抗增殖效果。在BALB/c裸鼠荷瘤模型中，联合使用Wnt3a（2 μg/kg）可显著减弱α-番茄碱（25 mg/kg）的抑瘤效果，表现为肿瘤体积和重量增加，证实Wnt/β-catenin信号抑制是α-番茄碱抗肿瘤作用的关键机制。

RelB上调介导治疗抵抗

转录组分析发现α-番茄碱处理可持续上调非经典NF-κB转录因子RelB的表达。通过挖掘GEO数据库（GSE235401、GSE272162、GSE164561）发现，RelB在帕博西尼处理的胃癌细胞、奥希替尼耐药的肺癌细胞和小檗碱处理的肝癌细胞中均呈现上调趋势。临床数据分析显示，RelB高表达的肝细胞癌患者总体生存率和无病生存率显著降低。Western blot验证α-番茄碱处理可时间依赖性升高RelB及其上游调控因子NIK和磷酸化p100蛋白水平，但p52亚基表达不变。5XNFκB报告基因实验显示药物处理可激活NF-κB信号活性，而Wnt3a处理无此效应。

遗传学操作验证RelB功能

通过CRISPR/Cas9技术构建RelB敲除细胞株，并利用pBabe载体建立RelB过表达模型。荧光素酶报告实验表明RelB过表达或敲除并不影响Wnt/β-catenin信号活性，提示两条通路独立发挥作用。功能实验显示，RelB过表达可促进HepG2细胞增殖并减弱α-番茄碱的抑瘤效果，而RelB敲除则抑制基础增殖并增强药物敏感性。使用2 μM RelB特异性抑制剂RS47处理可单独抑制细胞增殖，与α-番茄碱联用产生协同增效作用。

动物模型验证协同治疗效果

在HepG2裸鼠移植瘤模型中，设置野生型对照组、RelB敲除对照组、野生型药物处理组和敲除型药物处理组。21天干预结果显示，α-番茄碱单药或RelB缺失均可抑制肿瘤生长，但联合处理（RelB敲除+α-番茄碱）抑瘤效果最为显著，表现为肿瘤体积和重量显著减少。Western blot分析证实，野生型肿瘤经α-番茄碱处理后RelB表达上调，从体内水平验证了RelB介导的耐药机制。

讨论与展望

α-番茄碱在0.1-100 μg/mL浓度范围内呈现剂量依赖性抗肿瘤活性，其作用机制涉及多信号通路调控。除Wnt/β-catenin通路抑制外，RNA测序揭示的细胞外基质组织、NOTCH信号、5-HT受体信号等通路的改变也可能参与其抗肿瘤效应。RelB作为NF-κB家族成员，在多种癌症中被证实与治疗抵抗相关，本研究首次在肝癌模型中揭示其介导α-番茄碱耐药的作用。值得注意的是，Wnt/β-catenin与RelB信号通路互不干扰，独立发挥作用，这为联合靶向治疗提供了理论依据。虽然目前研究主要基于HepG2细胞系和移植瘤模型，未能完全反映肿瘤微环境异质性和不同肝癌亚型的特性，但研究结果支持进一步开发α-番茄碱与RelB抑制剂的联合治疗方案。未来需开展毒理学评估和正常组织效应研究，推动该植物化学物向临床转化。

结论

本研究系统阐明了α-番茄碱在肝细胞癌中的双重作用机制：一方面通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥抗肿瘤效应，另一方面通过诱导RelB表达产生治疗抵抗。遗传学实验和动物模型均证实，靶向RelB能显著增强α-番茄碱的治疗效果。该研究为开发植物化学物与精准靶向相结合的肝癌治疗新策略提供了重要理论基础，展现了植物药理学与肿瘤治疗学交叉融合的应用前景。