NMDA受体依赖的体外集群皮层网络重复激活序列调制机制研究

本综述系统探讨了体外四集群皮层神经网络在NMDA受体拮抗剂（MK-801）干预下产生的独特动力学重构现象。研究发现2 nM MK-801在降低网络整体兴奋性（MFR降低）的同时，通过选择性削弱集群间连接（INTER）并增强集群内连接（INTRA），促使重复激活序列从灵活多变状态转向稳定持久状态。这种功能连接重组（CI0同步性分析）揭示了模块化网络在低兴奋状态下维持自持活动的机制，为理解神经网络信息编码（NMDAR依赖可塑性）和神经精神疾病病理机制提供了新视角。

　　

1 Introduction

神经网络研究已从单一神经元功能转向群体神经元协同工作机制。多电极阵列（MEA）技术的发展使得体外构建具有空间结构的神经网络成为可能，其中四集群互连皮层神经网络模型展现出节律性爆发活动和重复激活序列特征。N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体作为突触可塑性的关键介质，其拮抗剂MK-801可抑制短时程（STP）与长时程增强（LTP）。本研究通过MK-801干预探讨NMDAR在神经网络记忆样行为中的作用机制。

2 Materials and methods

2.1 Establishment of compartmentalized cortical networks on MEAs

采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）约束装置在平面MEA上构建四集群神经网络模型。十字形PDMS掩模臂长2 mm，宽0.6 mm，厚0.3 mm，经70%乙醇灭菌后可逆对齐于MEA。从E18-19 SD大鼠胚胎皮层获取神经元，经胰蛋白酶（0.125%）和DNase（0.05%）消化后，以1,500 cells/mm2密度接种于多电极阵列。培养5天（DIV5）移除掩模使神经突向外生长，第18天（DIV18）进行记录。培养介质转换为BrainPhys添加NeuroCult SM1（2%），每周两次半换液。

2.2 Electrophysiology and data analysis

使用MEA2100系统（10 kHz采样率）记录自发活动，保持37°C与5% CO?环境。采用精确时间尖峰检测（PTSD）算法（阈值8倍噪声标准差）识别 spike，字符串法（最少5个spike，最大间隔100 ms）检测 burst，自适应算法（20%电极参与，爆发间隔100 ms）识别网络爆发（NBs）。通过高斯核（100 ms窗）平滑计算瞬时放电率（IFR），以IFR峰值确定集群激活时间。使用香农多样性指数评估激活序列多样性，总 spike 概率边缘算法分析功能连接，CI₀指数（±1 ms窗口积分比）量化神经元对同步性。

MK-801采用浓度梯度（1 nM至10 μM）顺序给药，每次记录前稳定5分钟。通过Hill方程拟合标准化平均放电率（MFR）提取IC₅₀值，选择2 nM（低于最低IC₅₀）进行部分受体抑制。统计采用Kolmogorov-Smirnov检验、Wilcoxon符号秩检验（配对样本）和Bonferroni校正t检验（α=0.05）。

3 Results

3.1 4-cluster networks display enhanced temporal organization compared to non-clustered network

四集群网络较非集群对照表现出显著增强的时间组织性。累积频率分析显示重复激活序列出现右移（p=1.1×10^?3），香农均衡指数证实实验序列多样性显著高于随机模拟（p=0.00016）。表明空间结构工程促进了非随机重复模式的出现，为记忆样行为提供了基质。

3.2 NMDA receptor blockade with MK-801 reduces network activity and alters repetitive sequence dynamics

2 nM MK-801显著降低网络兴奋性：MFR（p<0.05）和MBR（p<0.05）下降，IBI延长（p<0.05），但BD保持不变。重复序列数量减少（Wilcoxon检验p=0.036），但保留序列的持续时间显著延长（累积频率右移，p=9.8×10^–3）。表明网络从灵活多变状态转向少量稳定模式的优势表达。

3.3 Functional connectivity remodelling under MK-801

功能连接重构呈现双向变化：集群间连接数量减少（p<0.05）而集群内连接稳定；连接权重在集群内（p<0.05）和集群间（p<0.05）均增强。CI₀分析显示集群间同步性降低而集群内同步性提升（p<0.05）。这种重构解释了活动传播减少与局部序列持续性增强的悖论现象。

3.4 Washout restores baseline activity, sequence dynamics, and connectivity

清洗后MFR部分恢复，IBI减少（不显著），但MBR仍低于基线。重复序列特征与功能连接参数（数量、权重、CI₀）均趋向基线水平，表明NMDA受体阻断效应具有可逆性，体现了神经网络的动态可塑性特征。

4 Discussion and conclusions

研究证实NMDAR信号在维持神经网络兴奋性和序列多样性中的核心作用。MK-801诱导的功能连接重组揭示了模块化网络的半自主特性：集群内连接的强化（CI₀同步性增加）支持低兴奋状态下的自持循环活动，而集群间连接的削弱导致全局整合能力下降。这种"功能闭合"现象表明重复激活序列可能反映网络自身组织特性而非单纯依赖可塑性机制。研究为理解神经网络信息编码（spatiotemporal dynamics）和神经精神疾病（NMDAR功能障碍相关）提供了新型体外研究平台。