血小板功能相关基因MAPK3与GRB2作为ST段抬高型心肌梗死潜在诊断标志物的鉴定与验证

本研究通过生物信息学分析与实验验证，首次筛选并证实MAPK3（ERK1）和GRB2作为STEMI血小板功能相关关键基因，其参与止血、凝血与血小板活化通路（AUC>0.7），为急性心肌梗死的精准诊断与靶向治疗提供了新视角。

　　

引言

心肌梗死（Myocardial Infarction, MI）是全球死亡与残疾的首要原因，其中ST段抬高型心肌梗死（ST-segment Elevation Myocardial Infarction, STEMI）作为急性冠脉综合征的危重表现，其核心病理机制为动脉粥样斑块破裂或侵蚀引发血栓形成与冠状动脉闭塞，导致心肌氧供失衡。血小板在冠脉血栓形成与疾病进展中扮演关键角色，然而目前临床仍缺乏评估血小板功能障碍的可靠生物标志物。尽管既往研究已识别出若干血小板相关基因（如P2RY12、整合素αIIbβ3）及表观遗传调控因子（如miR-223、miR-126、HDAC6）参与梗死相关血栓形成机制，但其诊断敏感性、特异性及临床转化仍受限。因此，本研究旨在通过整合生物信息学与实验验证策略，系统筛选STEMI患者血小板功能相关基因特征，评估其在急性冠脉血栓形成中的机制参与及诊断潜力。

数据来源

研究从基因表达汇编（Gene Expression Omnibus, GEO）数据库下载GSE59867与GSE123342数据集。GSE59867基于Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array平台，包含111例MI患者入院首日外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）样本与46例对照PBMCs样本；GSE123342作为验证集，涵盖65例MI患者与22例对照PBMCs样本。此外，从MSigDB数据库获取480个血小板相关基因。

差异表达基因鉴定

采用limma R包（3.58.1版）分析GSE59867数据集中MI与对照样本的基因表达差异，以调整后P值<0.05为阈值，共识别12,617个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），其中4,457个上调、8,160个下调。通过VennDiagram包对DEGs与血小板相关基因取交集，获得245个血小板功能相关差异表达基因（Differentially Expressed Platelet-Related Genes, DEPRGs）。

KEGG与GO富集分析

使用clusterProfiler包（4.8.3版）对DEPRGs进行基因本体（Gene Ontology, GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。GO分析显示，DEPRGs主要参与生物学过程如止血（hemostasis）、血液凝固（blood coagulation）、凝血（coagulation）与体液水平调控；细胞组分富集于血小板α颗粒（platelet alpha granule）、血小板α颗粒腔（lumen）与分泌颗粒腔；分子功能集中于微管运动活性（microtubule motor activity）、磷酸酪氨酸残基结合（phosphotyrosine residue binding）与磷酸化氨基酸结合。KEGG通路分析表明，DEPRGs显著富集于血小板活化、趋化因子信号通路、松弛素信号通路与Ras信号通路（调整后P值均<0.05）。

蛋白互作网络构建

通过STRING数据库构建245个DEPRGs的蛋白互作（Protein-Protein Interaction, PPI）网络，并利用Cytoscape的CytoHubba插件按Degree值筛选前10个枢纽基因（hub genes），包括AKT1、FN1、ACTB、MAPK3、MAPK1、PIK3R1、GNB1、PIK3CA、GRB2、RHOA与SRC。

表达分析与ROC曲线分析

Wilcoxon秩和检验显示，在GSE59867数据集中，SRC、AKT1、RHOA、MAPK3、ACTB、FN1、GNB1与GRB2在MI样本中表达显著上调，而MAPK1、PIK3CA与PIK3R1显著下调。受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线分析评估枢纽基因诊断效能，AKT1、MAPK3、MAPK1、PIK3R1、PIK3CA与GRB2的曲线下面积（Area Under Curve, AUC）均大于0.7，显示良好诊断潜力。其中MAPK3与GRB2在独立验证集GSE123342中保持表达趋势一致性（MAPK3: P=1.6×10^?5，AUC=0.808；GRB2: P=8.2×10^?7，AUC=0.759），故被确定为关键基因。

GSEA分析与相关性分析

基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）揭示GRB2与MAPK3均与“FcγR介导的吞噬作用”（FC GAMMA R mediated phagocytosis）通路相关。Spearman相关性分析表明MAPK3与GRB2呈显著正相关（cor=0.4367, P<0.05）。

miRNA与转录因子调控网络预测

通过miRNet数据库预测关键基因上游调控网络，构建包含71节点、137边的miRNA-靶基因互作网络，其中度值大于2的miRNA被可视化，提示MAPK3与GRB2可能受复杂转录后调控。

人外周血样本验证

收集30例STEMI患者急诊入院时PBMCs与30例年龄性别匹配的稳定性冠心病（Stable Coronary Artery Disease, SCAD）对照样本，qPCR验证显示GRB2（P<0.0001）与MAPK3（P<0.0001）在STEMI患者中显著上调，与生物信息学预测一致。

小鼠心肌梗死模型验证

构建C57BL/6小鼠左前降支结扎心肌梗死模型，qPCR检测显示：MAPK1在梗死心肌中下调（P=0.0450），MAPK3上调（P=0.0104），PIK3CA呈下降趋势（P=0.0295），GRB2显著下调（P<0.0001）。其中MAPK1、MAPK3与PIK3CA表达模式与人外周血谱一致，而GRB2在鼠心组织与人PBMCs中表达趋势相反，提示其调控可能存在组织特异性与疾病阶段依赖性。

讨论

本研究通过多组学整合策略鉴定出MAPK3（ERK1）与GRB2作为STEMI血小板功能相关关键基因。MAPK3作为丝裂原活化蛋白激酶家族成员，不仅参与肿瘤进展，近年研究揭示其在心肌损伤中至关重要——抑制MAPK3可显著减轻缺血诱导的心肌细胞凋亡，且其为血小板活化信号的核心靶点。衔接蛋白GRB2通过介导JAK2酪氨酸磷酸化促进心脏纤维化形成，负调控miR-378可抑制胶原沉积并减轻纤维化程度；既往研究证实GRB2表达与心功能恢复呈负相关，且其在血小板活化信号中起关键作用。本研究发现MAPK3与GRB2共同富集于“血小板活化”通路，提示缺血刺激可能调控二者表达，激活血小板活化信号并参与MI发生。MAPK3-GRB2轴不仅有望作为STEMI早期诊断的双分子标志物，更可能成为潜在治疗靶点，兼具抑制血栓形成与减轻不良心肌重构的双重潜力。

然而，GRB2在人体外周血与小鼠心肌组织中的表达悖论提示其调控存在时空异质性，可能受样本类型、检测时间点及底层机制影响。未来需扩大样本量，结合单细胞测序技术解析特定功能细胞中靶基因表达，并依托体外模型深入探讨候选基因具体机制。

优势与局限性

本研究优势在于系统整合生物信息学与实验验证，方法严谨且候选标志物诊断效能优异（AUC>0.7）。局限包括临床验证样本量较小、GRB2表达种属与组织不一致性、外周血样本未能完全反映血小板功能、动物模型仅检测术后14天基因表达而缺失急性期动态变化、且缺乏细胞实验功能验证。未来需开展多中心研究扩大样本，建立时间序列样本库解析基因表达动态，获取血小板样本深化研究，并开发多标志物诊断模型提升STEMI早期诊断准确性。

结论

本研究鉴定GRB2与MAPK3为血小板功能相关基因，可作为STEMI潜在诊断标志物；富集分析表明其参与止血与血小板活化通路；ROC曲线证实其诊断准确性高（AUC>0.7）；人PBMCs与动物模型验证支持其临床价值，为STEMI风险分层与精准诊断提供新依据。