口腔鳞癌瘤内微生物丰度与载量对免疫微环境（CD4+/CD8+/FOXP3及PD-L1）的调控机制研究

本研究深入探讨了口腔鳞癌（OSCC）瘤内微生物组的组成特征及其与肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和免疫检查点PD-L1的关联。通过16S rRNA测序和qPCR技术，发现特定菌门（如Spirochaetota、Proteobacteria）与T细胞浸润水平显著相关，且微生物载量与CD4+ T细胞呈负相关。研究揭示了瘤内微生物通过调节免疫微环境促进肿瘤免疫逃逸的潜在机制，为OSCC的免疫治疗提供了新的生物标志物和干预靶点。

　　

1 Introduction

口腔鳞癌（OSCC）是一种起源于黏膜鳞状上皮的恶性肿瘤，全球年新增病例超过37万，5年生存率仅50%。传统风险因素包括吸烟、饮酒和遗传易感性，而肿瘤微生物组作为癌症标志的新维度，在OSCC发展中起关键作用。瘤内微生物通过调控宿主免疫系统与慢性炎症，间接促进肿瘤进展。2020年Nejman等研究首次证实肿瘤内存在独特微生物群落，主要定位于癌细胞和免疫细胞内。尽管细菌仅占肿瘤细胞总量的约3%，但其通过多层面机制重塑肿瘤微环境（TME），尤其影响肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的功能与组成。PD-L1作为免疫检查点蛋白，是当前头颈部鳞癌（HNSCC）免疫治疗的唯一已验证生物标志物。本研究旨在系统分析OSCC瘤内微生物组与TILs（CD4⁺/CD8⁺/FOXP3）及PD-L1的相互作用，探索其作为诊断生物标志物的潜力。

2 Materials and methods

研究收集了45例OSCC组织样本、10例癌旁对照和8例正常口腔微生物对照。通过16S rRNA测序（V3-V4区）分析微生物组成，qPCR（靶向V4–1区）定量细菌载量。免疫组化检测CD4⁺、CD8⁺、FOXP3和PD-L1表达。统计学分析采用SPSS 26.0，非参数检验用于微生物数据，Spearman相关分析评估细菌载量与TILs的关系。

3 Results

3.1 Participant characteristics

45例OSCC患者中男性占77.78%，平均年龄56.78岁。原发部位以舌部为主（66.67%），病理分化程度以中分化（51.11%）居多，TNM分期以T2（35.56%）为主，淋巴结转移率33.33%。

3.2 Composition and diversity of intratumoral microbiome

门水平优势菌群包括Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidota。OSCC组α多样性（Chao1、Shannon、Simpson指数）显著低于正常对照组，但与癌旁组无显著差异。β多样性分析显示OSCC与正常组微生物群落结构差异显著。LEfSe分析鉴定出OSCC相关标志菌群（如Proteobacteria、Mycobacterium），ROC曲线提示Bradyrhizobium、Acinetobacter和Mycobacterium具有诊断潜力。

3.3 Relationship between intratumoral microbiome and clinical characteristics

Spirochaetota丰度与分化程度相关，Actinobacteriota与T分期和淋巴结转移相关。吸烟与饮酒史降低Actinobacteriota丰度，但肿瘤部位未显著影响微生物组成。

3.4 Functional prediction

PICRUSt预测显示OSCC微生物富集于KEGG通路如Ansamycins生物合成、Valine/Leucine/Isoleucine生物合成等，提示代谢重编程与免疫调节功能。

3.5 Relationship between intratumoral microbiome and TILs

Spirochaetota富集于CD4⁺和CD8⁺低浸润组，Proteobacteria与CD8⁺高浸润相关，Actinobacteriota与FOXP3低浸润相关。微生物α多样性与PD-L1表达无显著关联。

3.6 Relationship between intratumoral microbial load and TILs

OSCC组细菌载量显著高于癌旁组。细菌载量与CD4⁺、CD8⁺和FOXP3均呈负相关，仅CD4⁺的相关系数（-0.309）具有统计学意义。

4 Discussion

4.1 Intratumoral microbiome characteristics in OSCC

口腔微生物组是人体最复杂的生态系之一。OSCC瘤内微生物α多样性降低与生态失衡一致，Proteobacteria升高提示菌群失调。具核梭菌（Fusobacterium nucleatum）等特定菌属的致癌作用已在结直肠癌中明确，链球菌（Streptococcus）和卟啉单胞菌（Porphyromonas）亦与OSCC进展相关。微生物组成与肿瘤分期、转移及生活方式因素（吸烟/饮酒）的关联，反映了微生物-宿主互作在肿瘤演进中的动态作用。

4.2 Intratumoral microbiome and the TME of OSCC

HNSCC的TME以效应T细胞与调节性T细胞（Tregs）比例失衡为特征。本研究发现微生物载量与CD4⁺ T细胞浸润显著负相关，可能与微生物相关分子模式（MAMPs）通过Toll样受体激活NF-κB通路，诱导慢性炎症及T细胞耗竭有关。虽未发现PD-L1与微生物参数的显著关联，但既往研究提示微生物可通过调控CTLA-4、募集CD8⁺ T细胞（如双歧杆菌Bifidobacterium）或代谢产物（如肌苷）影响免疫治疗应答。靶向微生物干预（如消除具核梭菌或补充益生菌）在多种癌症模型中显示协同增强免疫治疗的效果。瘤内微生物作为TME的核心组分，其调控策略为改善OSCC免疫治疗应答提供了新方向。