利用vicilin隐藏肽的线性和构象表位模型改善坚果过敏诊断的研究

本研究深入探讨花生（PN）与核桃（WN）过敏中由vicilin隐藏肽（VBP）介导的IgE交叉反应机制。通过肽微阵列和竞争抑制ELISA技术，文章揭示了VBP保守的α-发夹结构及其线性/构象表位在区分花生过敏（PNA）、核桃过敏（WNA）及双重过敏（PWA）表型中的诊断潜力，为开发精准过敏诊断工具提供了新思路。

　　

1 Introduction

花生与树坚果（如核桃、山核桃、腰果和开心果）过敏在约30%的食物过敏个体中共存，其共同致敏机制主要归因于食物过敏原间交叉反应表位的存在。交叉反应的发生源于患者血清IgE无法区分致敏原与其他结构或序列相似的蛋白质，可能导致临床过敏反应或无关结合。约60%的主要植物食物过敏原属于四类蛋白质家族：醇溶蛋白、杯形蛋白（cupin）、脯氨酸蛋白和Bet v 1超家族。杯形蛋白作为种子储存蛋白，包含vicilin（7S球蛋白），其结构包含三个保守区域：信号肽、N端富含半胱氨酸的引导序列（Leader Sequence, LS）以及成熟vicilin结构域。本研究聚焦于LS区域内的vicilin隐藏肽（Vicilin-Buried Peptides, VBPs），其特征是由两个保守CxxxC基序间的二硫键介导的共同α-发夹折叠（α-hairpinin motif），最初被认为参与病原体抗性。花生vicilin LS（AH1LS）中的单一VBP（AH1.1）与核桃Jug r 2 LS（JR2LS）中的三个VBP（JR2.1, JR2.2, JR2.3）均具有IgE反应性，被认定为新的过敏原家族。这些VBPs的三维结构已通过NMR光谱解析，其线性IgE表位通过肽微阵列鉴定，其中JR2.1包含最多线性表位。本研究旨在通过VBPs这一结构相似的小分子模型，解析IgE交叉反应的机制，并评估其在线性和构象表位层面对花生过敏（PNA）、核桃过敏（WNA）及双重过敏（PWA）的诊断区分能力。

2 Materials and methods

研究纳入85例经口服食物激发试验（OFC+）或明确过敏史确认的过敏患者血清（PNA=36, WNA=28, PWA=21），另收集10例无坚果过敏对照血清。通过间接ELISA筛选出30例具有足够IgE水平及血清量的样本（PNA=10, WNA=14, PWA=6）用于后续竞争抑制ELISA（ciELISA）及肽微阵列分析。所有血清样本获取均符合机构审查委员会规定及人体受试者保护政策。

核桃Jug r 2 LS及其三个VBP（JR2.1, JR2.2, JR2.3）通过重组表达纯化，花生VBP（nAH1.1）从花生粉中通过阳离子交换色谱纯化。间接ELISA中，微孔板包被50 ng纯化JR2LS或nAH1.1，血清稀释后孵育，HRP标记抗人IgE抗体检测结合。ciELISA中，将递增浓度竞争者（完整LS或VBP）与血清或抗JR2.1单克隆IgE（6D12）预孵育后加入包被板，测量450 nm吸光度（OD₄₅₀）。ImmunoCAP ISAC免疫分析检测血清对完整坚果过敏原的IgE结合。肽微阵列使用Jug r 2、Ara h 1及LS的重叠15肽（5氨基酸偏移）合成点样，检测血清IgE结合。

统计分析使用R 4.2.1和lme4包构建线性混合效应模型（LMM），比较不同过敏组间ciELISA OD₄₅₀和肽微阵列IgE结合强度的估计边际均值（EMMs），计算错误发现率（FDR）校正_p值，显著性阈值设定为<0.05。

3 Results

3.1 Human monoclonal IgE antibody against Jr2.1 binds specific peptide in Jr2ls

抗JR2.1人单克隆IgE抗体（6D12）通过ciELISA验证其与JR2LS构象表位的结合特异性。6D12特异性结合位于JR2.1 N端螺旋（氨基酸21-36）的肽段5（CQEYCRRQGQGQRQQ）。竞争曲线显示，完整JR2LS和折叠JR2.1片段均为高亲和力竞争者（IC₅₀分别为0.35 nM和0.54 nM），而JR2.2和JR2.3为低亲和力抑制剂（IC₅₀分别为27.1 nM和25.6 nM）。饱和竞争实验中，JR2.1抑制率高达95%，显著高于nAH1.1（45.4%）和Ara h 2（5.8%），表明6D12对JR2.1构象表位具有高度特异性。

3.2 Indirect and competitive IgE binding to the peanut VBP (nAH1.1) and all three walnut VBPs (JR2.1, JR2.2, JR2.3)

ISAC组分分析显示，WNA血清主要结合核桃过敏原（Jug r 1, Jug r 2），PNA血清结合花生过敏原（Ara h 1, 2, 3, 6），PWA血清同时结合两类，验证了过敏状态但提示单一诊断工具不足。间接ELISA中，提取物结合强度高于相应LS，OD₄₅₀>0.5可预测LS结合。30例血清用于ciELISA分析：WNA血清中，所有三个WN VBP均竞争抑制JR2LS结合，nAH1.1抑制最弱；PNA血清中，nAH1.1抑制最强，WN VBP抑制较弱；PWA血清中，所有VBP均显示不同程度竞争。nAH1.1包被板中，WN VBP在WNA血清中抑制率高于PNA血清，表明WNA IgE更偏好结合JR2LS VBP。

3.3 Walnut Jug r 2 VBPs compete for the same monoclonal IgE in human sera

equimolar组合竞争实验显示，WN VBP组合（如JR2.2+JR2.3）未产生叠加抑制效应，其竞争曲线与单个优势VBP（如JR2.3或JR2.1）相似，提示不同VBP竞争结合相同特异性IgE分子，可能源于同一B细胞克隆。单克隆IgE 6D12实验进一步证实，JR2LS仅能结合一个IgE分子，支持构象表位结合的空间位阻假说。

3.4 Linear and conformational IgE binding to VBPs differ between WNA, PNA, and PWA and non-allergic subjects

肽微阵列显示，PNA血清在AH1.1中识别两个免疫优势线性表位（肽A10, A13），在JR2.1（J12）和JR2.2（J14）中各识别一个；WNA血清在JR2.3中识别十个显著肽段，或可作为WN特异性过敏的诊断指标。LMM分析表明，线性表位中，AH1.1可区分WNA与PWA、WNA与PNA及PWA与对照；JR2.1和JR2.3可区分所有过敏组与对照；JR2.2无区分能力。构象表位ciELISA中，JR2LS包被板中nAH1.1竞争可区分WNA与PNA、PNA与PWA；WN VBP（JR2.1, JR2.2, JR2.3）及JR2LS竞争可区分WNA与PNA、WNA与PWA，但无法区分PNA与PWA。这些结合模式为区分过敏表型提供了依据。

4 Discussion

植物进化中产生的VBPs作为抗菌肽（AMPs），虽序列相似性低，但通过保守α-发夹结构维持IgE交叉反应性。本研究证实，VBPs的线性和构象表位结合模式可区分PNA、WNA和PWA表型。线性表位分析显示，WNA和PWA血清识别更多VBP表位，JR2.3线性表位或为WN特异性标志。构象表位竞争揭示不同过敏组对VBP的亲和力差异，且组合竞争无叠加效应，支持单一IgE克隆识别多VBP的机制。统计模型（LMM）在小样本中有效识别组间差异，但研究存在样本选择偏倚、样本量小、未控制混杂因素及单克隆抗体局限性等不足。未来需扩大样本验证VBPs诊断预测能力，并探索其他过敏原中类似发夹结构在交叉反应中的作用。整合线性和构象表位数据有望提升食物过敏诊断准确性。