一种改良的新生儿兔模型用于研究坏死性小肠结肠炎，该模型的动物存活时间相对较长

《Frontiers in Physiology》：Development of a refined neonatal rabbit model of necrotizing enterocolitis with relatively longer survival

本实验成功构建了改良型新生兔坏死性小肠结肠炎（NEC）动物模型，通过静脉营养（PN）延长模型生存期至9.83±4.26天，显著优于传统模型（2.55±1.21天）。病理学评分显示模型组（2.09±0.66至3.07±1.36）较对照组（0.33±0.49）显著升高（p<0.001），血清CRP、TNF-α、IL-10水平均升高，而occludin、ZO-1和zonulin表达呈剂量依赖性下降。该模型通过优化营养支持方案和延长观察周期，更接近临床NEC病程发展。

　　本研究旨在开发一种能够更贴近临床特征的坏死性小肠结肠炎（NEC）动物模型，从而为NEC相关研究提供更加有效的支持平台。研究采用了2周龄的哺乳期兔子作为实验对象，通过优化传统的建模方法，探索如何在动物模型中更真实地再现NEC的病理过程。实验将兔子分为三组：正常对照组（Group A）、传统建模组（Group B）和改良建模组（Group C），每组各12只。研究过程中，对兔子的总体健康状况、建模后的存活率和存活时间进行了每日监测，同时通过组织病理学评估和生化指标检测，分析模型的成功程度及NEC对机体的影响。

### 一、研究背景与意义

坏死性小肠结肠炎是一种严重影响早产儿的严重胃肠道疾病，其发病机制复杂，涉及多种因素，如早产、配方奶喂养、肠道微生物定植、肠道炎症以及缺氧-缺血损伤等。该病常表现为肠道水肿、出血、坏死，严重时可能导致肠道穿孔，威胁生命安全。临床治疗手段包括益生菌、抗生素及支持性治疗等，但疗效有限，部分病例仍需进行手术切除坏死肠段。然而，手术治疗存在较高的死亡率和术后并发症风险，如短肠综合征、神经发育迟缓和败血症等。因此，建立一个能够更贴近临床的动物模型，对于深入理解NEC的发病机制和评估潜在治疗策略具有重要意义。

当前的NEC动物模型多采用高渗配方奶、低温和缺氧等方法进行诱导，但这些模型存在一些明显的局限性。首先，这些模型的发病时间与人类新生儿的发病窗口不一致，人类NEC通常发生在出生后14至21天之间，而传统模型往往在诱导后2至3天即出现死亡，无法模拟临床中更长的病程。其次，由于存活时间较短，难以进行长时间的观察和干预研究。此外，许多研究在建模的同时即开始治疗干预，这可能导致实验结果的混淆。最后，传统模型中仅使用高渗配方奶进行营养支持，忽略了临床中复杂的营养管理方式，如静脉营养（PN）的应用。

为了解决上述问题，本研究提出了一种改良的NEC动物模型。该模型在保留传统诱导方法的基础上，引入了静脉营养作为主要的能量来源，以延长兔子的存活时间并为后续实验提供更长的观察窗口。通过这种方式，不仅能够更真实地反映NEC的病理过程，还为研究该病的治疗策略提供了更可靠的基础。

### 二、实验设计与方法

实验共使用了36只2周龄的新生哺乳期兔子，按照体重分为四个组别，每组12只。在实验开始前，排除了3只体重异常的兔子，确保各组的均匀性。Group A作为正常对照组，仅接受母乳喂养，不进行任何干预。Group B为传统建模组，接受高渗配方奶、低温和缺氧处理。Group C为改良建模组，在接受相同建模条件的同时，还额外给予静脉营养支持。

在建模过程中，兔子被放置于4°C的低温环境中10分钟，随后被置于含5%氧气的密闭缺氧舱中10分钟，每日两次。高渗配方奶的配制比例为10克Abbott Plus蛋白粉与75毫升Gimlet奶替代品混合，每日三次灌胃，每次15毫升/公斤体重。为确保实验的可行性，兔子在建模前接受为期3天的母乳适应期，以模拟自然喂养环境。改良组的兔子在建模期间持续接受静脉营养支持，营养液配方参考了已有的临床研究，并进行了适当调整，以满足兔子在建模期间的能量需求。

为了确保实验的伦理合规性，所有涉及动物的实验均通过了Gannan Medical University附属Pingxiang医院的动物伦理委员会批准。实验过程中，对兔子的健康状况进行每6小时一次的观察，包括精神状态、进食行为、活动能力、排便情况、腹部膨胀和呼吸困难等指标。对于出现严重症状的兔子，实验人员按照伦理规范进行人道处理，以确保样本的完整性。

### 三、实验结果分析

在实验的观察过程中，传统组和改良组均出现了明显的NEC相关症状，而正常组的兔子则没有明显异常。传统组的兔子在建模后的36小时内开始表现出精神萎靡、反应减弱和活动减少，48小时后症状加剧，出现严重腹泻和血便，死亡率显著上升。改良组的兔子则在建模后的第7天开始出现类似症状，第8至9天出现腹泻和死亡，但其整体存活时间明显长于传统组。数据显示，传统组的平均存活时间为2.55天，而改良组的平均存活时间为9.83天，这表明静脉营养的引入显著延长了兔子的生存期。

在体重变化方面，正常组的兔子体重持续增加，而建模组的体重则显著下降。改良组的体重下降幅度大于传统组，这可能与更严重的肠道损伤和能量消耗有关。此外，通过组织病理学评估，传统组和改良组均表现出肠道组织的严重破坏，包括绒毛结构的破坏、黏膜下层水肿、出血以及肠道壁的变薄和坏死。这些病理变化与临床NEC的表现高度相似，表明两种建模方法均能有效诱导NEC，但改良组的病情发展更为缓慢，这可能与其更长的存活时间有关。

在生化指标检测方面，传统组和改良组的兔子均表现出显著升高的促炎因子水平，包括C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素10（IL-10），同时肠道屏障蛋白如occludin和ZO-1的表达水平显著降低。这些结果表明，NEC不仅引发了全身性的炎症反应，还破坏了肠道屏障功能，导致肠道通透性增加。尽管改良组的某些指标（如CRP、IL-10和ZO-1）略高于传统组，但差异并不显著，这可能意味着两种建模方法在某些方面具有相似性。

通过Western blot检测，进一步确认了肠道屏障蛋白的表达水平变化。结果显示，传统组和改良组的occludin和ZO-1蛋白表达均显著低于正常组，表明肠道屏障功能受损。然而，两种建模组之间并未出现显著差异，这表明改良组的引入虽然延长了存活时间，但并未显著改变NEC的病理特征。

### 四、讨论与意义

本研究的结果表明，改良的NEC模型在多个方面优于传统模型。首先，改良组的兔子存活时间显著延长，达到了9.83天，而传统组仅为2.55天。这不仅提供了更长的观察窗口，还为后续的治疗干预研究创造了条件。其次，改良组的病情发展更为缓慢，与临床中NEC的病程更为接近，提高了模型的临床相关性。此外，改良组的兔子在建模后接受静脉营养支持，这与临床中对NEC患儿的营养管理方式相似，有助于更真实地模拟疾病进展。

尽管改良组的存活时间有所延长，但其病理特征与传统组之间并未出现显著差异。这表明，即使在延长了生存期的情况下，NEC的核心病理变化仍然存在，且其严重程度与传统组相当。然而，延长的生存期使得研究人员能够更全面地观察疾病的发展过程，并进行更深入的干预研究。在传统模型中，由于存活时间较短，研究往往只能在疾病早期阶段进行，而改良模型则提供了更长时间的实验窗口，有助于揭示NEC的晚期病理变化和潜在的治疗靶点。

此外，本研究还发现，改良组的兔子在建模后的生存率显著高于传统组。在实验第4天，改良组的生存率为75.0%，而传统组仅为8.3%。到了第11天，改良组的生存率进一步下降至50.0%，但仍然显著高于传统组的0%。这些结果表明，静脉营养的引入在一定程度上缓解了建模过程中造成的营养不良和代谢紊乱，从而提高了兔子的生存率。

然而，本研究也存在一些局限性。首先，样本量相对较小，可能影响结果的统计学可靠性。其次，虽然静脉营养的引入有助于延长存活时间，但其具体的生理和分子机制尚未完全阐明。最后，尽管改良模型在某些方面优于传统模型，但目前的NEC模型仍基于对疾病病因和发病机制的不完全理解，因此未来的研究需要进一步探索这些机制，并通过更大的样本量验证当前的发现。

综上所述，本研究建立的改良NEC模型在多个方面具有优势，包括更长的生存时间、更贴近临床的疾病进程以及更真实的治疗干预条件。该模型不仅有助于研究NEC的病理机制，还为评估潜在治疗策略提供了可靠的基础。此外，该模型的应用可能不仅限于NEC研究，还可拓展至其他严重肠道疾病模型，如严重的急性胰腺炎、溃疡性结肠炎和胆管炎等。未来的研究可以进一步优化该模型，以提高其在临床转化研究中的价值。