硝酸镧缓解盐胁迫下甘草（Glycyrrhiza uralensis）生理抑制与生长恢复的机制研究与多变量耦合预测模型构建

本综述系统探讨了硝酸镧（La(NO3)3）对盐胁迫下甘草（Glycyrrhiza uralensis）光合作用（Pn, Gs, Ci, Tr）、抗氧化酶系统（SOD, POD, CAT）、根系形态建成及药用次级代谢产物（如glycyrrhizic acid, liquiritin）积累的多维度缓解效应，并创新性引入NRBO-LSSVM-ABKDE耦合模型实现生理响应精准预测，为盐渍化地区药用植物栽培与抗逆调控提供新策略。

　　

1 Introduction

土壤盐渍化是全球农业可持续发展的严重威胁之一，它阻碍了世界各国作物产量的提高，严重的盐胁迫甚至导致作物死亡。然而，盐害土壤可能成为培育耐盐经济植物的可耕地。因此，在这类土地上战略性地选择和种植具有显著经济价值的耐盐作物，是提高盐碱地生产力的有效且迅速的方法。

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）是一种属于豆科的药食两用植物，其干燥根作为传统药材，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、止咳、保肝、免疫调节和抗氧化等多种功能。其根中的甘草酸和甘草次酸分别比蔗糖甜50倍和250倍。因此，其根和根提取物被广泛用于药品和食品的生产。然而，过度开采导致其野生种群数量和规模严重减少，使栽培甘草成为野生药材的替代品。尽管成年甘草对土壤盐分胁迫具有较高的耐受性，但其幼苗表现出较弱的耐盐性，并且经常因盐胁迫而遭受根腐病和高死亡率，显著降低了其在盐碱地的种植潜力。迄今为止，大量研究表明，外源物质的施用是提高幼苗耐盐性的最有效策略之一。虽然胁迫环境可能促进甘草根中某些药用成分的浓度，但它们显著抑制根的生长并降低药用器官的产量，导致这些成分的含量显著下降。为此，我们希望找到一种创新方法，既能有效增加盐胁迫下甘草根中功能化合物的浓度，又能显著促进其根生物量，从而提高药食两用器官的产量和质量。

稀土元素是一组在生物体中非必需但普遍存在的元素，已成为农业应用中有希望的候选者。镧是土壤中最丰富的稀土元素之一，以肥料成分的形式广泛应用于农业生产。关键的是，在初步筛选和现有文献中，镧在增强植物耐盐性方面表现出优于其他几种稀土元素的功效，特别是在调节离子稳态和抗氧化防御系统方面。适当浓度的镧显著改善作物生长并增强其对胁迫环境的耐受性。然而，镧的功效取决于具体的植物种类和施用浓度。

传统的实验方法大多使用单因素或正交设计来优化甘草的处理。然而，由于其生理反应过程的非线性和多变量耦合特性，仅依靠经验设计和线性分析难以充分揭示各种因素之间的相互作用，也无法实现复杂处理参数的精确预测和优化。虽然先前的研究已经探索了各种策略，包括稀土元素，用于缓解甘草的盐胁迫，但一个显著的研究空白仍然存在：没有人整合先进的预测模型来系统优化硝酸镧的应用参数（特别是浓度）以最大化耐盐性。随着人工智能和机器学习技术的快速发展，支持向量机（SVM）由于其良好的泛化能力以及在小样本和非线性建模方面的优势，已广泛应用于农业、环境、生物医学等领域的预测建模任务。然而，标准SVM模型在处理参数调整和高维复杂数据方面仍存在一些局限性。为了填补这一空白并实现盐胁迫下硝酸镧应用的精确优化，本研究引入了一种新颖的多变量耦合预测模型。我们围绕关键生理指标构建了一个多变量响应模型，并创新性地引入了Critic客观加权方法，构建了一个适用于甘草盐胁迫响应测试的综合指标体系，以确保系统中各指标权重的合理性和区分度。在此基础上，本文首次在该背景下提出了一种混合模型，整合了牛顿-拉弗森基于优化（NRBO）、最小二乘支持向量机（LSSVM）和自适应带宽核密度估计（ABKDE）。这种新开发的NRBO-LSSVM-ABKDE模型旨在准确模拟和预测增强甘草幼苗耐盐性的最佳硝酸镧浓度，代表了一种显著的方法学进步。

此外，为了验证所提出模型在预测准确性和稳定性方面的优势，本文引入了三种由主流群体优化策略构建的比较模型，包括粒子群优化算法-最小二乘支持向量机（PSO-LSSVM）、北方鹰优化算法-最小二乘支持向量机（NGO-LSSVM）和冠豪猪优化算法-最小二乘支持向量机（CPO-LSSVM）。通过全面的性能比较和分析，系统评估了不同优化算法在生理响应建模中的适用性，为后续复杂的植物胁迫响应建模提供方法学参考和技术支持。

总之，研究了La(NO₃)₃对NaCl处理下甘草幼苗光合气体交换能力、抗氧化酶活性、根生长、根生物量和次级代谢产物积累的影响，并确定了提高甘草耐盐性的最佳硝酸镧用量。基于无损检测的胁迫程度预测方法可用于指导人工种植甘草的快速实施补救措施，从而将损失降到最低。

2 Materials and methods

2.1 Materials

本实验使用的甘草种子由石河子大学甘草研究所提供，并由Miao Ma教授鉴定。

2.2 Plant growth conditions

实验地点位于石河子大学校园（北纬44°30′80′′，东经86°05′66′′）。石河子的主要气候类型为温带大陆性气候，夏季日照时间长，干燥炎热，冬季寒冷，平均海拔450米。图1显示了2021年5月至10月实验地点平均日温度（A）、平均日照时长（B）和平均月降水量（C）的变化。温度、日照时长和可见太阳时数据来自中国气象科学数据网（https://data.cma.cn/）。

2.3 Experimental design

选择了30个塑料盆（直径25厘米，高25厘米），共有6个处理，每个处理重复5盆，使用沙壤土（沙:土混合比为3:7）作为栽培基质，于2021年5月15日在每个盆中均匀播种6粒甘草种子，播种深度为1厘米。所有盆均位于一个单一均匀的实验地块（10米×15米）内，以确保相同的宏观气候暴露。所有处理均统一经历自然温度/降水 regime（由距离地块50米的气象站每小时数据确认）。关键气候变量（温度、降水）在图1中量化。

当第三片叶出现时，每个塑料盆施用尿素（N ≥ 46%）14.99 g·m^-2，过磷酸钙（P₂O₅ ≥ 46%）23.99 g·m^-2，硫酸钾（K₂O ≥ 50%）10.49 g·m^-2混合施肥，肥料分5次施用，每20天一次。塑料盆采用随机区组设计排列，每周随机改变一次位置。在整个实验过程中，每天给植物浇水，并通过称重法确保60%的相对持水量。

当幼苗第五片叶出现时，随机选择25盆进行NaCl处理，每盆灌溉300 mL 160 mM NaCl溶液，另外5盆（CK）灌溉等量蒸馏水，每两周一次，共5次。在初始处理一周后，将5种浓度的La(NO₃)₃溶液（0, 0.25, 0.5, 0.75 和 1.00 mM）施用于NaCl处理组，每种浓度5盆，每次添加300 mL La(NO₃)₃溶液，每两周一次，共5次。因此，本研究包括6种处理（图2）。盐处理和La(NO₃)₃处理交替施用，两种处理间隔一周。幼苗于2021年9月17日收获。

2.4 Determination of chlorophyll content and photosynthetic parameters

叶绿素含量测定：于7月15日使用叶绿素含量分析仪（SPAD-502, Chlorophyll Meter Model, Minolta Co., Ltd, Japan）测量每个处理100片叶的相对叶绿素含量，并计算其平均值。

光合参数测定：使用LI-6400光合分析仪（LI-6400, Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE, USA）于7月15日上午9:00至11:00测定甘草幼苗顶部第三片完全展开叶的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）和胞间CO₂浓度（Ci）。光强设置为1200 μmol·m^-2·s^-1。CO₂浓度设置为400 μmol·L^-1，相对湿度和温度与环境条件匹配（分别为22.2 ± 5.0% 和 25.7 ± 4.0°C）。每片叶测量100次，并计算每个参数的平均值。

2.5 Determination of antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content

光合参数测定后，从每个处理中随机选择100株个体，使用试剂盒（SOD-BC0170, POD-BC0095, CAT-C017, 北京索莱宝科技有限公司，中国）测定其叶片和根中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。采用硫代巴比妥酸法测定叶片和根中的丙二醛（MDA）含量。使用分光光度计读取450、532和600 nm处的吸光度，使用以下方程计算MDA浓度：

MDA (mol·g^-1FW) = 6.45 (A₅₃₂ - A₆₀₀) - 0.56A₄₅₀

2.6 Determination of root morphological indexes and biomass

于2021年9月17日收获所有植物，从每个处理中收集每株植物的第五片完全展开叶，使用Epson数字扫描仪（Expression 11000XL; Epson, Suwa, Japan）扫描以计算叶面积，然后分别放入纸袋中。收集每个处理组的茎和叶，放入标记的纸袋中。用流水仔细冲洗根部直至表面无土壤，使用Epson数字扫描仪扫描，使用根系图像分析系统软件（Win RHIZO Pro2012b; regent Instruments Inc, Quebec City, QC, Canada）测量总根长（TRL）、主根最大直径（MTD）、主根长度（TL）、根体积（RV）、根平均直径（AD）、根分支数（Tips）等。然后，将每个处理的根放入纸袋中。将装有叶、茎和根的袋子在105°C的烘箱中加热30分钟，然后在70°C下干燥至恒重。称量每株植物的茎、叶和根生物量，并计算其平均值。根据以下公式计算根冠比和比叶面积：

根冠比 (R-S) = 根干重 / 地上部干重

比叶面积: SLA (cm²·g^-1) = 叶面积 / 叶干重

2.7 Determination of secondary metabolites of G. uralensis

准确称取每个处理0.500 g干燥并精细研磨的根粉末，转移至10 mL离心管中，然后每管加入5 mL甲醇，室温提取24小时，然后将离心管置于超声提取器（KQ-300E, 昆山超声仪器有限公司, 中国）中室温超声2小时。以12,000 rpm离心15分钟，收集上清液。使用高效液相色谱（HPLC）（Agilent 1200; Agilent Technologies, CA, USA）测定上清液中甘草酸、甘草次酸、 liquiritin、liquiritigenin和isoliquiritigenin的浓度。使用紫外-可见分光光度计（UV-1900, Shimadzu, Japan）测量溶液中的总黄酮浓度。具体步骤如下：

2.7.1 Determination of glycyrrhizic acid, glycyrrhetinic acid, liquiritin, liquiritigenin and isoliquiritigenin

(1) 精确称取每种次级代谢物标准品2.0 mg，分别转移至10 mL容量瓶中。用甲醇溶解标准品并稀释至最终浓度为200 μg·mL^-1。用甲醇将储备液进一步稀释成浓度为1, 10, 50, 100, 250, 500, 和1000 ng·mL^-1的一系列标准溶液。以离子峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X, ng·mL^-1）为横坐标绘制标准曲线。五种代谢物的线性方程如下：

glycyrrhizic acid: Y = 87.2X - 3.76, R² = 0.999

glycyrrhetinic acid: Y = 136.8X - 122.4, R² = 0.999

liquiritin: Y = 750.9X + 356.9, R² = 0.999

liquiritigenin: Y = 509.2X + 925.6, R² = 0.998

isoliquiritigenin: Y = 8775.1X + 2617, R² = 0.999

结果表明，所有五种化合物在1–1000 ng·mL^-1浓度范围内，浓度与峰面积之间具有良好的线性关系。

(2) 甘草酸、甘草次酸、liquiritin、liquiritigenin和isoliquiritigenin的浓度检测：具体方法参考Jia et al。通过将这些数据与每株植物的根生物量相结合，计算每株植物中5种物质的含量。

2.7.2 Determination of total flavonoid content

(1) 精确称取3.00 mg liquiritin标准品（上海麦克林生化科技有限公司，中国）并完全溶解于5.0 mL甲醇中，所得标准浓度为0.4 mg·mL^-1。随后，取0, 25, 50, 100, 200, 和400 μL liquiritin溶液至离心管中，依次加入1 mL甲醇和250 μL 10%氢氧化钾溶液。静置5分钟后，用乙醇将溶液稀释至5 mL并充分混合。在490 nm处测量吸光度，并构建标准曲线。回归方程为：

Y = 0.026X - 0.056, R² = 0.999

(2) 黄酮提取：称取每个处理0.500 g甘草根粉末，转移至10 mL离心管中，加入5 mL甲醇。混合物超声提取1小时，然后在12,000 rpm下离心10分钟。上清液使用0.25 μm膜过滤。然后，取100 μL上清液与1 mL 10% KOH溶液和1 mL甲醇混合，混合物在室温下放置5分钟。然后用甲醇在10 mL容量瓶中稀释至刻度。每个处理重复三次，测量前充分混合。

(3) 黄酮浓度测定：使用紫外-可见分光光度计（UV-1900, Shimadzu, Japan）在490 nm处测量测试溶液的吸光度。根据回归方程计算黄酮浓度。每个处理重复100次，并计算平均值。通过将结果与每株植物的根生物量相结合，确定每株植物的总黄酮含量。

2.8 Data analysis:

2.8.1 Statistical analysis and Parson correlation analysis

所有实验数据使用IBM SPSS 19.0（IBM Corporation, Armonk, NY, USA）软件进行统计分析。使用OriginPro 2024b进行绘图。所有数据集均使用D'Agostino和Pearson omnibus正态性检验验证正态性。使用单因素方差分析（ANOVA）和Turkey's HSD事后检验（P < 0.05）检测不同处理间光合气体交换参数、抗氧化酶活性、根生长和药用化合物浓度的差异。

2.8.2 Critic empowerment:

具体计算过程见Meira et al。

2.8.3 NRBO-LSSVM-ABKDE coupling prediction model

(1) 牛顿-拉弗森（NRBO）优化算法：

图3是NRBO算法的原理图，从图中可以看出：

a. 种群初始化：在搜索之前，NRBO在解空间中随机生成一组解向量作为初始种群。每个解代表一个潜在问题的解。每个解从不同的位置开始，从多个方向探索整个区域。

NRSR基于牛顿迭代法，用于加速种群个体接近最优解的速度。它通过估计函数的一阶和二阶导数（变化趋势）来指导搜索方向，并结合扰动因子和平衡系数δ来提高搜索能力。一般来说，当种群探索因子搜索最优解时，它为探索因子提供最优解的正确方向和接近最优解的最快速度，使探索因子能够尽快找到最优解。

b. 牛顿-拉弗森搜索规则（NRSR）

c. 陷阱避免算子（TAO）：TAO是一种帮助个体跳出局部最优陷阱的机制。它通过随机扰动和混合解信息生成新的解向量，并引导种群从当前区域跳转到潜在更好的区域。

具体公式推导过程见Ravichandran et al的研究。

(2) NRBO-LSSVM-ABKDE模型计算步骤：

图4是NRBO-LSSVM-ABRDE算法的流程。从图中看，过程如下：

首先，导入数据并去除缺失值，确保数据的完整性和质量。划分训练集和测试集，并对训练集和测试集的数据进行归一化，确保所有特征都在相同的尺度范围内。

设置NRBO（牛顿-拉弗森）算法的相关参数，包括种群大小N、最大迭代次数（Maxlt）、探索空间的上下界（LU和LB）以及优化维度，优化的维度是γ和σ，它们决定了LSSVM的模型结构。

在NRBO算法中，粒子的位置代表LSSVM的超参数γ和σ，这两个超参数通过粒子群优化确定。粒子适应度公式如下：

f(P_i) = MSE_test(γ_i, σ_i)

P_i代表粒子的位置，包括当前粒子的γ值和σ值。

在每次迭代中，粒子根据其当前位置和速度计算步长，并通过牛顿-拉弗森搜索规则更新位置。为了避免陷入局部最优，使用陷阱避免操作。粒子的速度更新公式如下：

v_i^new = ω·v_i + c₁·γ₁·(p_i^best - p_i) + c₂·γ₂·(g_i^best - p_i)

其中，ω是惯性权重，控制粒子对上一个位置的惯性，C1和C2是学习因子，决定粒子对局部最优解和全局最优解的拉力。γ1和γ2是随机数，粒子的位置更新公式如下：

P_i^new = p_i + v_i^new

如果粒子的适应度优于当前全局最优解，则更新全局最优解pbest和gbest（即σ和γ），并通过多次迭代最终确定最优σ和γ。更新公式如下：

g^best = arg min_pi f(p_i)

p^best = arg min_pi f(p_i)

使用训练集和最优超参数（即σbest和γbest）初始化LSSVM模型并对其进行训练。训练过程通过最小化目标函数来调整模型参数。目标函数如下：

min_{ω, b, ∈} 1/2 w^Tw + γ/2 ∑_i=1ⁿ ∈_i²

根据ABKDE获得的概率密度分布信息，动态调整LSSVM的优化目标和权重分布，并通过引入密度权重ω（由ABKDE的密度估计值确定）优化模型的拟合效果。

最终的LSSVM模型通过最优参数配置进行训练并输出预测结果。

3 Result

3.1 Effects of La(NO₃)₃ on physiological characteristics of G. uralensis under salt stress

3.1.1 Effects of La(NO₃)₃ on photosynthetic parameters

在不添加La(NO₃)₃的情况下，NaCl处理显著降低了甘草的光合参数。与CK相比，S处理的比叶面积、净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度和蒸腾速率分别显著降低了21%、9%、42%、27%、24%和59%。这表明盐胁迫对甘草的光合生理造成了系统性损害。

La(NO₃)₃的应用促进了甘草的光合潜力。随着硝酸镧浓度从0.25 mM增加到0.75 mM，上述参数显著改善，在La(NO₃)₃浓度为0.75 mM时达到最佳值。与S处理相比，S+La0.75处理中的上述指标分别增加了70%、47%、61%、36%、42%和57%。这些结果表明，0.75 mM硝酸镧有效促进了盐胁迫下的气孔开放（Gs、Tr、Ci大幅增加）和叶片生长扩展（SLA大幅增加），并可能通过保护光合装置、增强抗逆性等非气孔机制全面显著地逆转盐胁迫的光合抑制效应，使净光合速率恢复了近一半。

3.1.2 Effects of La(NO₃)₃ on antioxidant enzyme activity and MDA content

与CK相比，S处理下甘草叶片中SOD、POD和CAT的活性分别显著降低了11%、54%和53%，MDA含量增加了9%。根中抗氧化酶活性和MDA含量的变化与叶片相似。S处理中3种酶的活性分别显著低于CK 30%、49%和39%。这表明NaCl处理通过抑制关键抗氧化酶的活性，打破了甘草活性氧代谢的平衡，导致ROS大量积累，进而攻击细胞膜并引起膜脂过氧化。

施用La(NO₃)₃显著促进了叶片和根中这些酶的活性，同时降低了MDA水平。随着La(NO₃)₃浓度从0.25 mM增加到0.75 mM，酶活性显著增加，最大值出现在S + La_0.75处理中。与S处理相比，S+La_0.75处理叶片中3种酶的活性分别增加了424%、117%和140%，其MDA含量降低了33%。根中酶活性分别增加了525%、133%和102%，MDA含量减少了29%。这表明施用La(NO₃)₃可有效激活甘草的抗氧化防御系统，降低膜脂过氧化程度，从而显著缓解NaCl胁迫引起的氧化损伤，其缓解效应是浓度依赖性的。

3.1.3 Effect of La(NO₃)₃ on the relative content of medicinal secondary metabolites

与CK组相比，S组中这些物质的含量分别下降了17%、3%、25%、31%、49%和21%。这表明NaCl处理严重抑制了甘草根中次级代谢物的合成和积累，削弱了其化学防御能力和环境适应性。然而，添加La(NO₃)₃显著增加了根中这些成分的含量。与CK相比，S + La0.75组中这些成分的含量分别增加了64%、129%、83%、99%、37%和58%。并且，与S组相比，它们分别增加了99%、133%、141%、181%、167%和98%。这证明施用La(NO₃)₃不仅逆转了盐胁迫对次级代谢的抑制作用，而且将其激活到远超出正常水平的“过度补偿”状态，大大增强了甘草的化学防御和适应性。

3.2 Effect of La(NO₃)₃ on root growth of G. uralensis under salt stress

3.2.1 Effects of La(NO₃)₃ on root morphology

与CK相比，S处理的主根长度、主根最大直径、总根长、平均根直径、总根体积和总根尖数分别显著降低了19%、18%、15%、21%、17%和9%。

施用La(NO₃)₃显著改善了上述指标。随着硝酸镧浓度的增加，在0.25-0.75 mM La(NO₃)₃处理下，这些指标显著增加，并在0.75 mM La(NO₃)₃处理下达到最大值。与S处理相比，S+La_0.75组的上述指标分别增加了56%、52%、89%、62%、86%和33%。

上述结果表明，盐处理导致甘草根系的系统发育抑制，严重损害了其吸收功能和锚定能力，这是植物地上部分生长受限的根本原因之一。然而，施用La(NO₃)₃有效逆转了盐处理对根发育的抑制作用，不仅恢复了根生长，而且在某些方面超过了正常水平，大大增强了植物的根际竞争力。

3.2.2 Effects of La(NO₃)₃ on the biomass

与CK相比，S组的上述参数分别降低了13%、38%和10%，表明盐胁迫（S）显著抑制了甘草的生长，特别是根发育。施用La(NO₃)₃有效缓解了这种盐胁迫，因为它明显促进了甘草的茎叶生物量、根生物量和根冠比。随着镧浓度的增加，这些指标在0.25-0.75 mM处理条件下显著增加，在0.75 mM时达到峰值。这种清晰的剂量依赖性反应表明，在此浓度范围内，镧作为盐胁迫下生长和根分配的强效刺激剂。与CK相比，S+La_0.75处理的上述指标分别增加了41%、37%和64%。值得注意的是，与S组相比，S+La_0.75组的这些指标分别增加了61%、122%和79%。这表明0.75 mM La(NO₃)₃