揭示亚马逊利什曼原虫胞外囊泡（EVs）在皮肤利什曼病中的免疫调节潜力及其对巨噬细胞极化的影响

本综述深入探讨了利什曼原虫（Leishmania amazonensis）来源的胞外囊泡（EVs）在美洲皮肤利什曼病（ACL）中的关键作用。研究通过蛋白质组学、免疫印迹及细胞功能实验，揭示了EVs携带gp63、HSP70等重要蛋白，能剂量依赖性地调控巨噬细胞（MΦs）的免疫活性：低浓度EVs促进MHC分子表达和IL-12产生，可能激活Th1免疫应答；而高浓度则抑制IL-1β+MΦs亚群，并激活精氨酸酶途径产生尿素，利于寄生虫生存。这些发现为基于EVs的疫苗设计和靶向宿主-寄生虫相互作用的创新疗法提供了重要理论依据。

　　

引言

利什曼病是由利什曼原虫属（Leishmania） protozoa引起的一组被忽视的疾病，通过受感染的雌性白蛉叮咬传播给人类和其他哺乳动物。美洲皮肤利什曼病（ACL）是其主要临床形式之一，由包括亚马逊利什曼原虫（Leishmania amazonensis）在内的多种病原体引起，每年导致数百万人严重残疾和社会耻辱。当前防治策略的局限性促使科学研究聚焦于胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs），这是一类脂质包裹的圆形纳米结构，能够携带大分子物质至受体细胞，在真核生物生物学中扮演重要角色。利什曼原虫来源的EVs在宿主发病机制中的作用备受关注，研究表明它们可能在调节宿主免疫反应中发挥关键作用。

材料与方法

研究采用MHOM/BR/1973/M2269、MHOM/BR/1987/BA125和MHOM/BR/1989/BA336三种亚马逊利什曼原虫 strains。EVs通过超速离心和基于聚合物的沉淀法（使用Exosome Isolation Reagent）从培养的前鞭毛体中纯化。使用透射电子显微镜（TEM）观察EVs形态，纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定其大小和浓度。蛋白质组成通过SDS-PAGE、免疫印迹（Western blot）和质谱（MS）进行分析。使用小鼠和人类特异性血清评估EVs的免疫原性。通过多参数流式细胞术、qPCR和比色法分析EVs对小鼠巨噬细胞系P388D1免疫活性的影响，包括基因表达、细胞表型、代谢活性和尿素/一氧化氮（NO） production。

结果

3.1 亚马逊利什曼原虫无生命前鞭毛体释放EVs

TEM图像显示，纯化的EVs呈圆形，外围有电镜密度较低的冠状层（corona-like layer），这与哺乳动物细胞来源的EVs特征一致。NTA分析表明，EVs size范围在40至378 nm之间，平均尺寸介于198 nm至226 nm之间，证实其包含外泌体（<100 nm）和微囊泡（>100 nm）两种类型。不同菌株的EVs在size和concentration上存在差异，但均以大型EVs为主。

3.2 EVs的蛋白质货物包含HSP70、gp63和α型蛋白酶体亚基

SDS-PAGE显示不同菌株的EVs protein profiles存在相似性和差异性。免疫印迹和质谱分析证实，EVs携带63 kDa表面糖蛋白（gp63）、70 kDa热休克蛋白（HSP70）和一个26.817 kDa的独特肽段，经数据库比对鉴定为α型蛋白酶体亚基（accession number A0A836KVE3）。这些蛋白质与寄生虫的生存和压力响应密切相关。

3.3 亚马逊利什曼原虫来源的EVs被实验感染小鼠和ACL患者的血清识别

Western blot分析表明，感染亚马逊利什曼原虫的小鼠血清和ACL患者血清 pool均能识别EVs的特定蛋白条带（例如50 kDa、52 kDa、94 kDa等），而健康个体血清无此反应。这表明EVs具有免疫原性，能够引发体液免疫反应，但其抗原性在不同菌株间存在差异，MHOM/BR/1973/M2269 strain的EVs反应性较弱。

3.4 EVs对宿主细胞发挥免疫调节作用

qPCR分析显示，低浓度EVs（3.54 μg/μL）和寄生虫本身能显著上调巨噬细胞（MΦs）先天免疫受体基因（tlr4, tlr9, nod2）的表达。同时，低浓度EVs还促进了促炎细胞因子il12p40和il1b的基因表达。然而，在蛋白水平，流式细胞术检测发现，与静息MΦs相比，经EVs、寄生虫抗原或活寄生虫处理的MΦs中，表达IL-1β的细胞亚群（IL-1β⁺MΦs）比例显著降低，表明可能存在转录后调控抑制了IL-1β的翻译。

3.5 暴露于EVs的巨噬细胞保持功能活性

resazurin还原实验表明，EVs处理24小时后，MΦs的代谢活性仅下降约25%，大部分细胞保持存活。流式细胞术分析表面MHC分子表达发现，低浓度EVs刺激能最大程度地促进MΦs表达MHC I和MHC II分子，而高浓度EVs（7.09 μg/μL）则抑制其表达，这种剂量依赖性的调节可能影响抗原呈递能力。此外，EVs刺激的MΦs尿素产量显著增加，而NO production则维持在基础水平，表明EVs激活了精氨酸酶途径，将精氨酸代谢为尿素和鸟氨酸，这有利于多胺合成、细胞增殖和组织修复，而非产生具有杀伤作用的NO。

讨论

本研究系统阐述了亚马逊利什曼原虫前鞭毛体释放的EVs在调节宿主巨噬细胞免疫应答中的双重作用。EVs携带包括gp63、HSP70和蛋白酶体亚基在内的多种功能蛋白，这些分子可能共同介导了对宿主细胞的复杂调控。

研究发现，EVs对MΦs的免疫调节呈现明显的浓度依赖性。低浓度EVs倾向于激活免疫反应：通过上调TLR4、TLR9和NOD2等模式识别受体（PRRs）的表达，并促进il12p40和il1b等促炎细胞因子基因的转录，同时增强MHC II分子的表面表达，这有利于抗原呈递和潜在Th1免疫应答的激活。然而，高浓度EVs则表现出抑制效应，下调先天受体表达并减少MHC分子表达，这可能通过递送大量抑制性抗原（如gp63）来干扰抗原 processing and presentation，从而利于寄生虫免疫逃逸。

尤为重要的是，尽管il1b基因转录上调，但IL-1β⁺MΦs细胞亚群却发生收缩，提示EVs可能通过microRNAs等机制在翻译水平抑制了IL-1β的产生。IL-1β是炎症反应的关键早期细胞因子，其可用性降低可能损害有效细胞免疫反应的早期激活。

在代谢层面，EVs引导MΦs激活精氨酸酶途径，产生尿素而非NO。这种代谢重编程有利于寄生虫在细胞内生存（尿素/鸟氨酸用于合成寄生虫生长所需的多胺），同时促进组织修复和胶原生成，有助于维持皮肤稳态，限制过度炎症病理损伤，从而促进慢性感染的建立。

综上所述，亚马逊利什曼原虫来源的EVs是一种重要的免疫调节工具，其剂量依赖性的效应可能有助于寄生虫在建立持续性感染的同时，适度调控宿主免疫反应以避免严重组织破坏。这些发现不仅深化了对利什曼病发病机制的理解，也为开发基于EVs的疫苗（利用其低浓度下的免疫刺激特性）或针对EVs介导的免疫调控通路的新型治疗策略（如干预其免疫抑制功能）提供了新的思路和靶点。未来的研究需要进一步在体内模型中验证这些发现，并深入探索EVs cargo中特定分子（如gp63, HSP70）的具体作用机制。