线粒体基因组测序揭示食管癌致病性变异与保护性单倍群D4的作用机制研究

本研究通过新一代测序技术（NGS）分析146例食管癌（EC）患者和120例健康对照的线粒体全基因组，发现EC群体存在1299个变异（含171个新发突变），鉴定出3个可能致病的tRNA变异（7496_T>C、5771_A>G、5613_T>A）及14个蛋白编码区有害变异，并首次揭示单倍群D4及其特异性SNPs（如8414_C>T和14668_C>T）可显著降低EC发病风险，为食管癌的遗传机制研究和早期筛查提供了新的分子标志物。

　　

1 Introduction

线粒体作为关键的细胞器，通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生能量并调控细胞凋亡、钙稳态及代谢信号传导。其基因组（mtDNA）全长16,569 bp，包含13个OXPHOS相关蛋白编码基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因，以及一个调控转录与复制的控制区（CR）。mtDNA易受致癌物影响，突变频率较核DNA高10-20倍，可能导致线粒体功能障碍并参与癌症发生。食管癌（EC）作为高致死性消化道肿瘤，其遗传易感性是重要风险因素，而针对胚系mtDNA变异的研究仍相对有限。既往研究多聚焦于高变区（HVR1），缺乏全基因组层面的分析。单倍群作为mtDNA变异的分类体系，与多种癌症风险相关，但其在EC中的作用尚存争议。本研究旨在通过全基因组测序，揭示四川北部EC高发区人群的mtDNA变异分布、致病性及单倍群关联。

2 Materials and methods

2.1 Sample collection and DNA extraction

研究纳入146例EC患者和120例健康对照，均来自四川北部高发区。采集外周血样本并使用EDTA抗凝管保存，通过天根血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA。本研究经川北医学院伦理委员会批准（NSMC [2022] 08和NSMC [2024] 026），所有参与者均签署知情同意书。

2.2 mtDNA amplification, template preparation, and sequencing

使用RealCap^? Human ChrMT Kit进行文库构建，通过多重PCR扩增目标区域，并在Illumina Novaseq6000平台上进行双端150 bp测序。

2.3 Sequencing data processing

使用fastp过滤低质量读数，BWA将序列比对至人类mtDNA参考序列（rCRS, NC_012920），并通过SAMtools和BCFtools检测变异位点及生成一致序列FASTA文件。

2.4 Variant annotation and pathogenicity prediction

变异注释依托MitoMap数据库，新变异定义为未收录于该库的突变。利用44种灵长类基因组评估进化保守性（CI > 75%视为高保守）。tRNA变异致病性通过MitoTip评分评估：>16.25为可能致病（LP），12.66–16.25为潜在致病（PP）。蛋白编码区变异则通过13种生物信息学工具（如PolyPhen2、SIFT、CADD等）预测，超过半数工具判定为有害则视为致病。

2.5 Determining heteroplasmic and homoplasmic variants

通过计算变异等位基因比例（HF）区分异质性（HF 1%–98%）和同质性（HF ≥ 98%），HF < 1%的变异被排除。

2.6 mtDNA haplogroups and SNPs

使用Haplogrep3平台基于PhyloTree 17进行单倍群分类，并筛选等位基因频率（MAF）≥ 5%的SNPs进行分析。

2.7 Population comparisons

获取潮汕地区119例及中国21个省份9209例mtDNA基因组数据，通过主成分分析（PCA）比较遗传关系。

2.8 Statistical analyses

采用Mann-Whitney U检验、卡方检验、Fisher精确检验和逻辑回归进行统计分析，显著性阈值设为P < 0.05。

3 Results

3.1 Distribution of mtDNA variations

在146例EC患者中共鉴定1299个变异，涉及1234个位点，其中D-loop和rRNA区变异数量最多。新变异占171个，包括19个非同义突变和10个移码突变。罕见变异（AF < 0.5%）占比72.5%。单碱基替换（如T>C、C>T）为主要变异类型，其中颠换较转换更易引发氨基酸改变。ATPase6、CYTB和ND5基因的非同义变异比例较高。EC组个体平均变异数（53.5）高于对照组（41.07），但无显著差异。EC组在ND2、COX1、COX2、12S rRNA和16S rRNA区域的变异数量显著多于对照组，编码区平均变异数亦更高（9.25 vs. 7.08, P = 1.55E?4）。

3.2 The level of heteroplasmy in mtDNA variations

共识别1298个mtDNA变异，其中异质性占45.2%，同质性占37.4%，其余为混合状态。插入/缺失（indel）在异质性变异中更常见（P = 6.43e?18），且多分布于非编码区和rRNA区。EC组异质性变异平均数量（34.78）显著高于对照组（10.97, P = 0.0394），且在ND2、ND4、ND6、COX1、COX2、12S rRNA和16S rRNA区域富集。

3.3 Pathogenicity prediction of mtDNA variations

在RNA编码区鉴定60个12S rRNA、199个16S rRNA和67个tRNA变异。基于频率和保守性筛选出14个tRNA变异，其中3个（5613_T>A、5771_A>G、7496_T>C）经MitoTip预测为可能致病，分别位于tRNA-Ala、tRNA-Cys和tRNA-Ser基因。7496_T>C此前已被报道与听力损失相关。蛋白编码区发现502个同义、212个非同义和10个移码变异，其中55个非同义变异经13种工具评估后，14个被超过半数程序判定为有害，包括11622_A>G（全部工具预测为致病）。这些变异分布于ND4、ND5、CYTB、ATP6、ATP8和COX3基因。

3.4 Association between mtDNA haplogroups and SNPs and EC risk in northern Sichuan population

单倍群分析显示，D4在对照组中频率（19.17%）显著高于EC组（9.59%），其携带者EC风险降低（OR = 0.447, P = 0.032）。筛选出的101个常见SNPs中，6个（302_A>AC、1824_T>C、1842_A>G、3010_G>A、8414_C>T、14668_C>T）与EC风险显著相关，其中8414_C>T和14668_C>T为D4特异性SNPs，进一步支持D4的保护作用。

3.5 Genetic relationship between Northern Sichuan EC high-incidence people with other populations

PCA分析显示，四川北部人群与云南、贵州（中国西南）人群遗传关系较近，而潮汕高发区人群则与福建、台湾（东南）人群聚类，表明两地EC高发人群无密切遗传关联。

4 Discussion

本研究首次在四川北部EC高发区完成线粒体全基因组测序，发现EC患者mtDNA变异数量及异质性水平均高于健康对照，且D-loop和rRNA区为突变热点。ND2、COX1、COX2等基因的变异富集提示OXPHOS功能障碍可能通过ROS积累和代谢重编程促进EC发展。异质性变异的高频出现表明其可作为EC潜在生物标志物。致病性变异预测揭示tRNA和蛋白编码区（如ND4、CYTB、ATP6）的突变可能通过破坏电子传递链功能、诱发氧化应激及能量代谢失衡驱动肿瘤发生。保护性单倍群D4的发现为EC遗传易感性提供了新视角，其与潮汕地区研究结果的差异可能源于人群遗传背景不同。本研究填补了地区性mtDNA数据库空白，为EC的机制研究、风险分层和早期干预提供了重要依据。局限性包括未评估环境与基因交互作用、工具预测偏倚及缺乏功能验证，后续需结合多组学分析和实验验证深化研究。