COVID-19与性别差异对自然杀伤细胞（NK）细胞毒性的影响机制研究

本综述深入探讨了COVID-19对自然杀伤（NK）细胞功能的系统性影响，揭示了患者体内NK细胞数量减少、成熟亚群（CD56dim CD57+）比例下降及细胞毒性功能受损的机制。研究通过多维度实验（包括流式细胞术、活细胞成像和质谱流式技术）证实了效应分子（如Granzyme B）表达降低、脱颗粒（CD107a）能力减弱、颗粒运输及免疫突触形成缺陷，并发现抑制性受体（如PD-1、CTLA-4）表达上调。特别值得注意的是，男性患者表现出更显著的NK细胞功能缺陷，且不同病毒变异株（VOCs）及地塞米松治疗对NK细胞功能存在差异化影响。该研究为理解COVID-19免疫病理机制及靶向NK细胞的治疗策略提供了重要依据。

　　

引言

COVID-19大流行由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起，全球已导致超过700万人死亡。自然杀伤（NK）细胞作为先天免疫的核心组成部分，在抗病毒免疫中发挥关键作用。尽管已知COVID-19患者淋巴细胞和NK细胞数量减少，但其功能变化机制尚不明确。本研究旨在系统分析住院中症COVID-19患者（PHWC-19）的NK细胞功能缺陷及其机制，并探讨性别、病毒变异株及药物治疗等因素的影响。

研究参与者与方法

研究纳入44名住院中症COVID-19患者（WHO临床进展量表4-5级）及45名健康对照者。通过Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs），并利用磁珠负选法分离原代NK细胞。细胞毒性实验采用721.221肿瘤细胞系作为靶细胞，通过CFSE/7AAD染色及流式细胞术检测杀伤效率。细胞内效应分子（Granzyme A/B/K、Perforin、Granulysin）及表面受体（PD-1、LAG-3、TIGIT等）表达通过流式细胞术和质谱流式（CyTOF）技术分析。脱颗粒能力通过CD107a暴露实验评估，效应分子释放水平通过ELISA检测。颗粒运输及突触形成动态通过活细胞成像（Cresyl violet标记颗粒、Tubulin tracker标记微管）结合ImageJ软件量化分析。

结果

NK细胞数量与亚群变化

质谱流式分析显示，PHWC-19患者外周血中NK细胞比例显著降低（9.8% vs 22.8%）。进一步亚群分析发现，成熟细胞毒性亚群CD56^dim CD57⁺ NK细胞减少，而未成熟亚群CD56^dim CD57^-比例增加，提示NK细胞向幼稚表型偏移。

细胞毒性功能受损

与健康对照相比，PHWC-19来源的NK细胞对721.221细胞的杀伤能力在5:1和10:1效靶比下均显著降低。年龄分析显示，年轻患者NK细胞功能缺陷更显著，而老年健康对照的NK细胞毒性反而随年龄增强。

效应分子与脱颗粒缺陷

细胞内效应分子检测显示，Granzyme B表达显著降低，且其荧光强度与细胞毒性正相关。脱颗粒实验表明CD107a暴露水平下降，且与细胞毒性正相关。ELISA检测发现，共培养上清中Granzyme A和B的释放量减少，但Perforin释放无显著变化。

颗粒运输与突触形成障碍

活细胞成像显示，PHWC-19来源的NK细胞与靶细胞结合后，颗粒与微管组织中心（MTOC）向免疫突触的极化过程受阻，颗粒-突触距离显著增大。同时，免疫突触宽度变窄，提示细胞间接触稳定性下降。

抑制性受体表达上调

流式细胞术发现PD-1表达显著上调，而LAG-3、TIGIT和CD94变化不显著。质谱流式亚群分析显示，在CD56^dim CD57^-及CD56^dim CD57⁺ NK细胞中，抑制性受体（PD-1、CTLA-4、CD158b）表达升高，激活受体（NKG2D、CD161）表达降低。聚类分析进一步证实特定受体共表达模式在患者中发生改变。

变异株、药物与性别的影响

不同变异株感染患者中，NK细胞功能缺陷程度趋势为Alpha > Delta > Omicron。地塞米松治疗未显著改变NK细胞毒性。性别分析显示，男性患者的NK细胞毒性缺陷更显著，且其抑制性受体表达变化更明显。地塞米松在男性中可能部分恢复NK细胞功能。

讨论

本研究系统揭示了COVID-19中NK细胞功能缺陷的多层次机制：数量减少、亚群失衡、效应分子表达降低、脱颗粒与释放受损、颗粒运输障碍及抑制性受体上调。这些缺陷在男性患者中更为突出，且受病毒变异株及药物治疗的调节。研究结果为开发靶向NK细胞的免疫疗法提供了理论基础，并强调了性别因素在COVID-19免疫应答中的重要性。