哈萨克斯坦服务犬群中犬细小病毒与圆环病毒共感染致致命胃肠炎暴发的分子溯源与进化分析

本研究报告了2023年哈萨克斯坦阿拉木图地区服务犬群中爆发的致命性胃肠炎疫情，通过PCR和高通量测序技术首次在中亚地区鉴定出犬细小病毒（CPV）和犬圆环病毒（CanineCV）的协同感染。研究揭示了CPV-2c变异株与亚洲谱系CanineCV的共流行特征，发现多个病毒基因突变可能增强毒力，并指出疫苗接种程序不当（如母源抗体干扰）及高密度饲养环境是疫情恶化的关键因素。该研究为犬类病毒性肠炎的防控提供了重要分子流行病学依据。

　　

引言

犬类传染性疾病对全球家养及工作犬构成持续威胁，其中犬细小病毒（CPV）、犬瘟热病毒（CDV）和犬圆环病毒（CanineCV）等高度传染性病原体引起的疫情常导致显著发病率与死亡率，尤其在幼犬或免疫幼稚动物中。高密度饲养环境（如犬舍、收容所）会加速病毒传播，造成死亡率超90%的暴发疫情。研究表明，CPV感染可在部分免疫或母源抗体保护的犬中持续亚临床传播，导致隐性排毒。新病毒株的出现与共感染现象进一步增加诊断和防控难度，例如CPV与CanineCV共循环被证实会加剧疾病严重度和疫苗突破病例。

CPV属于细小病毒科原细小病毒属，是已知最小病毒之一，可感染犬、猫、浣熊、狼及海豹等多种哺乳动物。该病毒在环境中稳定性强，适宜条件下可存活超过一年。CPV感染犬更易继发其他病原体感染，而圆环病毒复制在细胞再生组织（如CPV致坏死损伤区域）中增强。二者通常协同致肠炎发生。

CanineCV是无包膜二十面体单链环状DNA病毒，基因组约2 kb，2012年首次在美国发现。感染与血管炎、出血、出血性肠炎及腹泻相关。其Rep蛋白可抑制宿主免疫应答，促进CPV-2复制，加剧共感染临床表现。

本研究记录了哈萨克斯坦犬胃肠炎致命暴发事件，强调先进分子诊断在疫情调查中的重要性，并为中亚地区CPV与CanineCV共感染的分子特性提供首份区域见解。

材料与方法

研究遵循本地生物伦理委员会规范（批件号02-09–130）。共采集10只犬（含无症状者）的口咽拭子、直肠拭子及血清样本。因疫情报告延迟，仅能从隔离区 symptomatic 犬获取样本。样本包括3只6月龄以下幼犬、3只绝育雄犬和4只未绝育雌犬。拭子分存于DNA/RNA Shield试剂（Zymo Research）及-80°C病毒运输介质。

犬种构成含4只比利时牧羊犬、4只德国牧羊犬，以及荷兰牧羊犬和哈萨克Tazy犬各1只，均具不同疫苗接种史。PCR阳性样本合并建库。

疫苗接种史显示，犬舍2023年前使用Nobivac? DP（MSD Animal Health）联苗，后改用Biocan Novel DHPPi（Bioveta）多价活疫苗。成年犬按标准程序接种，幼犬因疫情紧急提前免疫。

采用OneTaq One-Step PCR试剂盒（NEB）进行PCR/RT-PCR筛查，靶向CDV、流感A病毒（IAV）、犬冠状病毒（CCoV）、轮状病毒及CPV。引物与循环条件参照已发表方案。核酸提取使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）。

建库使用QIAseq FX Single Cell RNA Library Kit（Qiagen）和NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit（NEB）。cDNA经NEB Fragmentase片段化（450–500 bp），连接Illumina适配体，纯化扩增后于MiSeq测序仪（Illumina v.3 chemistry, 2×300 cycles）测序。

生物信息分析采用LAZYPIPE流程：Trimmomatic去接头与低质量碱基，BWA-MEM过滤宿主序列，MEGAHIT进行de novo组装（meta-sensitive预设）。Geneious Prime软件进行同源性检索（BLASTn/BLASTx, E值<10^?25）。系统进化分析在MEGA X中完成（邻接法, 500次自举检验, Tamura-Nei模型）。病毒家族分布图用R ggplot2绘制，ORF分析在Geneious v2025.1进行。

结果

疫情描述与PCR筛查

2023年9月，哈萨克斯坦阿拉木图郊区高品种服务犬爆发急性胃肠炎，临床表现为嗜睡、抽搐、厌食、呕吐及出血性腹泻，致死率高。至11月底，共110只犬发病，幼犬死亡率显著。

PCR筛查显示所有样本IAV、CDV及CCoV阴性。8份样本检出CPV，2只犬轮状病毒阳性。8只CPV阳性犬中7只曾接种疫苗。

高通量测序与病毒组构成

Illumina MiSeq产出3,274,832条原始读段，质控后保留2,968,286条。De novo组装得20,158条重叠群（平均长502 nt，中位数360 nt）。病毒序列中圆环病毒科（Circoviridae）占42.3%，细小病毒科（Parvoviridae）占38%，二者合计超80%病毒读段。其余病毒如β乳头瘤病毒和慢病毒占比较低。

KZ_2024圆环病毒全长2,063 nt（支持读段14,453条），KZ_2024细小病毒全长5,058 nt（支持读段12,961条）。该分布与既往病犬肠道病毒组研究一致。

系统进化分析

KZ_2024细小病毒全基因组与中国2016年CPV毒株（MF805796）高度相似，支持CPV-2c为区域优势变异株。KZ_2024圆环病毒与东南亚毒株（泰国MZ826142；越南MT740195、MT740196）形成独立进化枝，与中国大部分圆环病毒（如MT063074）明显分化。

基因组特性

CanineCV KZ株基因组2,063 nt，GC含量50.6%，含两个反向ORF编码Rep（269 aa）和Cap（303 aa）蛋白。Cap基因鉴定4个独特氨基酸置换，Rep基因1个，为毒株特异性适应。Cap基因GC含量53.2%，偏好第一密码子位点G（33.6%）和第二位点A（32.6%）。Rep基因AT偏好（52.5%），A占31.3%。

CPV KZ株基因组5,058 nt，GC含量35.7%，含NS1（668 aa）和VP2（584 aa）等蛋白。VP2基因长1,755 nt，AT含量64.3%，第三密码子位点A（40.5%）和T（44.3%）占主导。NS1基因AT含量64.2%，A占38.0%。与参考序列相比，VP2基因存在多个独特氨基酸置换。

突变比较分析

CPV VP2基因鉴定置换370R、426E（关键突变）、440T，均为CPV-2c特征。NS1基因60位I→V置换亦为CPV-2c典型特征。其他位点如Y544F、E545V、L630P均符合CPV-2c变异株特性。

CanineCV Cap蛋白突变分析显示与中国和泰国分离株部分重合（位点13、16、29、58、79、95、101），与欧美毒株差异显著。关键免疫原性位点24R、50V、103R、111R未变。149G位点罕见，可能标志独特亚型。Rep基因鉴定独特突变Q8H及71C（仅见于哈萨克与泰国谱系），同时存在欧美特征突变115R和149Y。

讨论

胃肠炎是幼年家养食肉动物常见疾病，高密度饲养环境加剧爆发风险。本研究受影响犬年龄1月至6岁，主体为12月龄以下幼犬。CPV与犬肠道冠状病毒（CECoV）是犬胃肠炎最常见病毒病原，但本疫情中CCoV未检出。

病犬肠道病毒组除CPV与CanineCV外，通常含星状病毒、轮状病毒、博卡病毒及科布病毒。健康犬病毒组则以噬菌体（肌尾、长尾、短尾及微病毒科）为主。本研究中圆环病毒属（42.3%）和细小病毒属（37.8%）占绝对优势，其他病毒检出率低。

CPV在 vaccinated 犬中经PCR检出，高通量测序通过非疫苗特征突变确认野毒株。因样本合并建库，无法直接对比PCR与测序结果。

BLAST显示CPV序列与中国CPV-2基因型毒株MF134808.1（2017）、印度CPV-2a部分基因组OR296281（2019）及中国CPV-2b毒株MT165692（2017）高度同源（99.64%），表明属于CPV-2a/2b进化谱系。突变分析证实为CPV-2c型，地理邻近性暗示病毒可能自中国传入，国际参赛犬亦增加感染风险。

CanineCV与中国毒株OQ198057、OQ198058（2020–2021）及泰国毒株MZ826142、MZ826143（2020）高度相似，提示共同进化起源或传播路径。遗传分析显示其更接近亚洲谱系。

基因组分析发现CPV VP2基因多个独特突变（VP2负责宿主细胞结合与抗原性），NS1基因突变可能影响病毒复制与包装。类似地，CanineCV Cap与Rep基因独特置换提示遗传分化，其生物学意义需实验验证。作为单链DNA病毒，CPV与CanineCV均缺乏校对机制，导致持续遗传变异。

CPV、CanineCV及轮状病毒（少数案例）共感染可能加剧疫情严重度与死亡率。相较既往共感染报告，本疫情致死率更高，但症状相似。CanineCV非偶然发现， likely 与CPV协同致病。KZ_2024 CPV与亚洲流行CPV-2c及CanineCV毒株相似性表明区域流行性，但全球传播模式受地理、采样时间及犬只商业移动影响。

轮状病毒（呼肠孤病毒科）主要影响12周龄以下幼犬，引起水样腹泻与脱水，成人感染较轻但具人兽共患风险。本研究中轮状病毒阳性经中心参考实验室独立验证，但未获测序确认。

乳头瘤病毒（λ、τ、芯片乳头瘤病毒属）通过接触传播导致口腔或皮肤疣，通常自限，但免疫抑制犬可进展为鳞状细胞癌。慢病毒非犬类主要病原，仅偶见犬免疫缺陷病毒报道。

这些共感染病原体虽非主要致死原因，但凸显全面诊断在理解复杂疫情中的重要性。某些病原可加剧临床症状，尤其在应激或寄生虫负担背景下。先进分子诊断对解析犬群复杂疫情至关重要。

非病毒因素如 overcrowding 应激、寄生虫负担及气候因素（春、秋、冬季感染风险增加）亦加剧疫情。虽未进行原位杂交（ISH）与组织学检查，但圆环病毒作为主要致死剂的可能性极低，因其多作为CPV的继发病原。

犬舍饲养数百只犬，加速感染传播。所有犬接种多价疫苗Nobivac DP Plus，正确使用时应提供可靠免疫。尽管疫苗对CPV变异株保护力存疑，但研究显示CPV-2基础疫苗对CPV-2a/2b/2c具合理保护力（需正确程序）。本次疫情中幼犬提前免疫可能受母源抗体（MDA）干扰，导致“免疫窗口期”（2–3周）内易感——此时MDA不足以保护但可中和疫苗病毒。

因而，饲养条件、早期免疫及其他风险因素（高密度、遗传抗性、寄生虫）是疫情关键诱因。测序结果强调需监测CPV主感染与CanineCV共感染。修订幼犬免疫程序（考虑MDA水平）、改善饲养条件及系统监测可降低类似疫情风险。CPV疫苗遗传抗性发生率约千分之一，需前瞻性研究确定原发性疫苗失效流行率。

研究局限包括样本量小（n=10 vs. 总群>200）、疫情应急导致资源受限、缺乏组织病理学/ISH证据确认CanineCV原发性致病作用。血凝抑制试验（HAI）结果因重复不一致未纳入，且无病毒分离、疫苗效力测试或MDA滴度测量。