莫博替尼（Mobocertinib）及其杂质的反相高效液相色谱（Reversed phase HPLC）分析，以及对一种新的降解产物的结构与生物活性的研究

《Frontiers in Chemistry》：Reversed phase HPLC analysis of mobocertinib and its impurities and studies on the structure and biological activity of a new degradation product

mobocertinib是一种针对EGFR外显子20插入突变的非小细胞肺癌靶向药物，但其合成和储存过程中可能产生杂质影响疗效与安全。本研究开发了一种高效液相色谱法（RP-HPLC）实现 mobocertinib及其6种相关杂质（imp-A-F）的同时分离与定量检测，并通过核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）确认了新型杂质imp-A的结构，发现其通过迈克尔加成反应形成，并经MTT实验证实imp-A对多种肿瘤细胞（如A549、PANC-1等）具有抑制生长的活性。方法符合ICH指南，验证了特异性、灵敏度、精密度等关键参数，为药物质量控制及imp-A的潜在临床应用提供了依据。

　　在非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗中，靶向药物的应用已成为一种重要手段，尤其对于携带特定表皮生长因子受体（EGFR）突变的患者。EGFR突变主要发生在基因的18至21号外显子区域，其中常见的突变类型包括外显子19的插入缺失和外显子21的L858R取代突变。然而，随着研究的深入，EGFR外显子20插入突变（EGFRex20ins）也逐渐受到关注。这类突变与较差的预后相关，并可能导致受体构象改变，从而阻碍药物与活性位点的结合，引发对第一代和第二代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的耐药性。因此，EGFRex20ins突变成为NSCLC治疗的重要靶点。

Mobocertinib（TAK788）是一种新型的EGFR TKI，具有对EGFRex20ins突变的高度选择性，属于第三代EGFR-TKI家族，与Osimertinib类似。其临床应用已显示出良好的抗肿瘤活性，尤其在治疗携带EGFRex20ins突变的晚期NSCLC患者中表现突出。此外，Mobocertinib的两个主要代谢产物AP32960和AP32914也具有与母体药物相当的活性。因此，Mobocertinib在肺癌治疗领域展现出广阔的应用前景。然而，药物在合成和储存过程中可能产生杂质，这些杂质可能影响药物的疗效和安全性。因此，开发一种能够同时检测Mobocertinib及其相关杂质的高效分析方法显得尤为重要。

目前，关于Mobocertinib杂质的研究仍较为有限。已有研究通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）和核磁共振（NMR）等技术，对Mobocertinib的强制降解产物进行了分离、鉴定和结构分析。但这些方法在同时检测Mobocertinib和其杂质方面仍存在不足。为此，本研究提出了一种新型的反相高效液相色谱法（RP-HPLC），旨在提高检测的准确性和效率。该方法使用Agilent 5HC-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），通过优化流动相组成、梯度洗脱程序和紫外检测波长，实现了Mobocertinib及其相关杂质的有效分离和检测。

在方法开发过程中，研究人员发现Mobocertinib在不同降解条件下会产生多种杂质，其中一种新的降解产物被命名为imp-A。通过进一步的实验，研究人员成功解析了imp-A的结构，并揭示了其形成机制。imp-A的结构通过NMR和高分辨率质谱（HRMS）技术得到确认，显示出与Mobocertinib相似的芳香环结构，但具有不同的官能团和取代基。通过分析其化学反应路径，研究人员发现imp-A的形成涉及Michael加成反应，其中Mobocertinib分子中的α, β-不饱和酰胺基团可能受到亲核试剂的攻击，进而发生酮-烯醇互变异构反应，最终生成imp-A。

为了验证RP-HPLC方法的可靠性，研究团队按照国际协调会议（ICH）指南对其进行了系统性评估。评估内容包括方法的专属性、线性范围、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、稳定性、精密度和重现性。结果显示，该方法在0.1–20 μg mL?1的浓度范围内表现出良好的线性关系，且LOD和LOQ分别为0.02 μg mL?1和0.05 μg mL?1。此外，该方法在不同时间点的稳定性测试中也表现出优异的性能，表明其适用于实际样品的检测。精密度和重现性测试进一步确认了该方法的可靠性和重复性，所有结果均符合ICH规定的标准。

在方法的鲁棒性测试中，研究人员对流动相比例、检测波长、流速和pH值等参数进行了微调，以评估方法对实验条件变化的适应能力。结果显示，即使在这些参数发生轻微变化的情况下，Mobocertinib和其杂质的保留时间和分辨率仍保持稳定，表明该方法具有良好的鲁棒性。这一特性对于实际应用中的质量控制和过程开发具有重要意义，因为实验条件可能因操作或环境因素而有所波动。

除了对Mobocertinib杂质的分析，本研究还评估了imp-A的抗肿瘤活性。研究人员通过MTT法对多种肿瘤细胞系进行了实验，包括A549（肺腺癌）、MDA-MB-231（三阴性乳腺癌）、HepaRG（肝癌）、PANC-1（胰腺癌）和MKN-1（胃癌）细胞。实验结果表明，imp-A在不同浓度下均能有效抑制这些细胞的增殖。其中，A549细胞对imp-A的抑制作用最强，其半数抑制浓度（IC50）为24.1 μg mL?1，而PANC-1细胞的IC50为33.2 μg mL?1。IC50值越低，表示药物对细胞的抑制作用越强，因此imp-A在抑制A549细胞增殖方面表现出显著的潜力。

这一发现为抗癌药物的研发提供了新的方向。尽管目前的研究主要集中在imp-A的体外活性，但其在体内的药效和安全性仍需进一步探讨。未来的研究可以聚焦于imp-A的动物实验和临床前评估，以确认其在人体中的治疗效果和潜在毒性。如果这些研究能够证实imp-A的临床价值，它可能成为一种新型的抗癌药物，为NSCLC及其他恶性肿瘤患者提供更多的治疗选择。

此外，本研究还强调了在药物研发过程中对杂质进行系统分析的重要性。杂质不仅可能影响药物的纯度和稳定性，还可能带来未知的生物效应，包括毒性或药效增强。因此，建立一个能够同时检测药物及其杂质的高效分析方法，有助于提高药物的质量控制水平，并为后续的药物开发提供可靠的数据支持。在本研究中，RP-HPLC方法不仅实现了对Mobocertinib及其相关杂质的分离和检测，还为类似药物的分析提供了可借鉴的范例。

值得注意的是，imp-A的结构和形成机制为理解Mobocertinib的降解行为提供了新的视角。通过NMR和HRMS的分析，研究人员能够确定imp-A的分子量及其化学结构，并揭示其形成过程中涉及的化学反应。这些信息不仅有助于改进Mobocertinib的合成工艺，以减少杂质的生成，还可能为设计更稳定的药物制剂提供理论依据。同时，imp-A的抗肿瘤活性表明，某些降解产物可能并非完全无用，甚至可能具有潜在的药理活性。这一发现提示我们，在药物开发过程中，应更加关注杂质的生物效应，而不仅仅将其视为需要去除的副产物。

在实际应用中，RP-HPLC方法的建立不仅提高了检测效率，还降低了分析成本，使其在药物生产和质量控制中具有显著优势。该方法的操作流程相对简单，适用于实验室和工业环境中的常规检测。同时，其高灵敏度和良好的重现性使其能够检测低浓度的药物和杂质，这对于确保药物纯度和安全性至关重要。此外，该方法的稳定性测试表明，样品在室温下保存24小时后仍能保持良好的检测性能，进一步证明了其在实际操作中的可行性。

总的来说，本研究开发了一种高效、稳定且具有广泛适用性的RP-HPLC方法，能够同时检测Mobocertinib及其相关杂质。这一方法的建立不仅有助于提高Mobocertinib的质量控制水平，还为后续研究提供了基础。同时，imp-A的发现为抗癌药物的开发开辟了新的可能性，提示我们应更加关注药物降解产物的生物活性，以期发现更多具有治疗潜力的化合物。未来的研究应进一步探索imp-A的体内药效和安全性，并评估其作为新型抗癌药物的可行性。此外，还需对其他可能的降解产物进行系统分析，以全面了解Mobocertinib的降解行为及其对药物性能的影响。