TLR7/8激动剂刺激快速重塑非人灵长类B细胞抗体谱系多样性并诱导λ链偏向性免疫应答

本研究发现TLR7/8激动剂（IDR-053）能快速激活非人灵长类（NHP）B细胞，在48-72小时内显著增加抗体谱系多样性，并诱导具有λ链偏向性和高突变特征的记忆/效应样B细胞扩增。该研究通过抗体谱系测序（BCR repertoire sequencing）和流式细胞术（flow cytometry）揭示了TLR7/8激动剂作为疫苗佐剂通过激活固有免疫建立适应性免疫基础的新机制，为疫苗设计提供了重要见解。

　　

引言

Toll样受体7和8（TLR7/8）是识别病原体富含嘌呤的单链RNA（ssRNA）的模式识别受体（PRRs），近年来作为新型佐剂在疫苗研究中备受关注。然而其对适应性免疫应答特别是B细胞抗体谱系的影响尚不明确。本研究通过系统分析TLR7/8激动剂刺激后非人灵长类动物抗体谱系的动态变化，揭示了其免疫调节机制。

材料与方法

研究选用6只印度恒河猴（IRM）和6只非洲绿猴（AGM），注射25mg合成TLR7/8激动剂IDR-053。在刺激前（0小时）和刺激后8、24、48、72小时及1周采集外周血样本，分别进行流式细胞术分析和抗体谱系测序。采用5'-RACE方法扩增BCR repertoire，通过Illumina HiSeq2000平台进行测序。使用IMonitor流程进行数据分析，包括低质量读段过滤、V(D)J基因注释和CDR3区域鉴定。谱系定义为共享相同V-J基因且CDR3区氨基酸序列差异不超过1个错配的克隆群。

结果

TLR7/8激动剂激活T、B淋巴细胞

流式细胞术分析显示，刺激后24小时B细胞和T细胞（CD4⁺和CD8⁺）数量短暂减少，同时活化标志物HLA-DR（B细胞）和CD69（T细胞）表达上调。增殖标志物Ki67在IRM的B细胞和CD4⁺ T细胞中24小时增加，CD8⁺ T细胞72小时增加，而AGM中未见显著变化，表明TLR7/8激动剂引起淋巴细胞再分布和活化。

抗体谱系多样性变化与λ链偏向性

IgKL谱系分析显示，V/J基因使用的Gini指数在72小时至1周显著降低，表明基因多样性增加。特别值得注意的是IgL V基因使用频率显著增加，κ/λ比率下降，呈现明显的λ链偏向性。Shannon指数显示克隆型和谱系多样性在48-72小时显著增加，Top100克隆型频率下降，表明中等频率谱系扩增贡献了多样性提升。突变率分析显示高突变序列（>4%）比例在48小时增加，提示记忆/效应B细胞参与应答。

TLR7/8激动剂诱导谱系扩增的三种特征

通过频率、独特CDR3数量和突变率三个指标鉴定扩增谱系。在48和72小时，频率增加（log2FC>3）和独特CDR3数量增加（log2FC>2）的谱系显著多于减少谱系。突变率增加（log2FC>1.3）的谱系从8小时即开始增多。IRM中鉴定出4653个扩增谱系，其中42.0%同时满足两个以上特征标准；AGM中鉴定出3941个扩增谱系，38.7%满足多特征标准。

扩增谱系的特性分析

系统发育树分析显示扩增谱系中的抗体克隆从0小时到48/72小时经历类别转换（IgM向IgA）和体细胞高频突变（SHM）。扩增谱系频率变化与HLA-DR表达呈正相关（IRM r=0.88, p=0.03）。特别值得注意的是，扩增谱系呈现显著的λ链偏向性，κ/λ比率显著低于对照组。跨时间点分析显示超过51%的扩增谱系在所有时间点持续存在。个体间比较发现扩增谱系在基因使用和克隆型相似性方面都呈现高度 divergent 特征，表明TLR7/8激动剂诱导的是广泛多样的抗体应答。

扩增谱系起源于记忆/效应样B细胞

对刺激前（0小时）原始扩增谱系的分析显示，这些谱系含有更多IgA抗体和更少IgM抗体，所有同种型抗体都显示较高突变率（包括IgM）。按突变状态分组显示，IgA/G/E高突变序列（突变率>3%）占扩增谱系的60%，显著高于对照组；约20%为突变IgM序列，可能来源于IgM记忆B细胞。这表明TLR7/8刺激主要激活的是外周血中的记忆和效应样B细胞。

讨论

本研究首次系统揭示了TLR7/8激动剂单独刺激对非人灵长类抗体谱系的动态影响。TLR7/8激动剂在48-72小时内诱导B细胞广泛扩增，增加抗体多样性，并呈现λ链偏向性。扩增的谱系主要来源于高突变的记忆/效应样B细胞，具有高度多样性特征。这种广泛的B细胞激活为疫苗抗原应答提供了良好的免疫基础，解释了TLR7/8激动剂作为佐剂的有效机制。IRM和AGM的反应差异可能与其TLR7信号强度差异有关，这为不同模型选择提供了参考。研究建立的谱系鉴定方法可用于疫苗评价和免疫相关疾病研究。