植物功能群对土壤功能的影响超越种植密度：基于盆栽实验的机制解析

本研究通过盆栽实验揭示，在调控土壤多功能性（MFI）和氮矿化速率等关键生态过程中，植物功能群（PFGs）的作用显著强于种植密度。结果表明，豆科植物（Legumes）凭借其固氮特性及根系沉积效应，能显著提升根际土壤养分循环与微生物残体碳（BNC、FNC）积累，为优化草地生态系统管理提供了重要的理论依据。

　　

引言

植物功能群（PFGs）和种植密度是植物群落动态的两个重要特征，然而它们对生态系统功能的主效应和交互效应尚未得到系统分析，这限制了我们预测和管理群落变化引发的生态响应的能力。植物相互作用涉及竞争和促进之间的动态平衡。密度决定了种间竞争的强度，并直接影响植物生长、繁殖以及土壤性质和生态系统功能。在最佳范围内，增加种植密度可以增强资源获取、植被生产力和生态系统碳（C）储存。然而，过高的密度可能导致个体表现和生殖投资减少，潜在地破坏食物网并损害生态系统恢复力。目前，大多数关于种植密度的现有研究集中在生产力上，尤其是在森林和农业生态系统中。密度变化对草地中各种土壤功能的影响，如土壤氮（N）矿化、胞外酶活性和微生物残体碳，尚未得到系统研究。

PFGs之间的差异是生态系统功能的关键决定因素，因为它们通常比物种身份更好地解释生态系统过程，捕捉了与生产力、养分循环和胁迫耐受性相关的性状变异。在草地生态系统中，植物物种通常根据其在生产力中的功能作用分为豆科植物、非豆科草本植物、C₃禾草和C₄禾草。豆科植物尤其因其固氮能力而增强土壤N有效性、初级生产力和C固存，从而提高生态系统对干扰的抵抗力。同时，C₄禾草通常与较高的生物量积累相关，归因于其更高效的光合作用、更强的胁迫耐受性和优越的资源利用效率。比较不同PFGs如何调节生产力和关键生态系统过程（如养分循环）可以为优化土地管理提供机制基础。

土壤N矿化由土壤微生物驱动，决定了植物生长的N可用性。土壤N矿化也受植物凋落物质量和数量、土壤有机质（SOM）、根系分泌物和根系分布的影响。植物细根可以快速降解并将N释放到土壤中，从而加速净土壤N矿化速率。类似地，PFGs可以影响与土壤养分循环相关的微生物活动。例如，豆科植物可以通过共生固氮增加微生物生物量并减少微生物残体N的再利用，从而增加微生物残体C的积累和土壤有机碳（SOC）含量。然而，土壤功能如何随植物密度和PFGs变化仍不清楚。

根际是受植物根系影响最强烈的区域，对植物群落变化敏感。植物根系向周围土壤释放各种有机化合物（如有机酸、碳水化合物、氨基酸），影响根际土壤的微生物和生物地球化学特性。研究表明，土壤生态过程在整体土壤和根际土壤之间存在显著差异。例如，刺槐根际土壤的土壤细菌多样性以及与C、N和磷（P）循环相关的土壤酶活性高于整体土壤。类似地，野燕麦根际土壤的总N矿化速率比整体土壤快约十倍，尽管两种土壤的硝化潜力相似。然而，土壤功能在根际和整体土壤中如何受植物密度和PFGs变化的影响尚不清楚。

材料与方法

本研究旨在通过盆栽实验研究PFGs和种植密度对土壤功能的影响。实验于2021年3月至9月在西北农林科技大学（陕西杨凌，34°16′49″ N, 108°4′59″ E）进行。研究地点属暖温带半湿润大陆性气候，年平均气温12.9°C，年平均降水量649.5毫米。为最小化人为干扰和表层管理遗留效应的影响，盆栽实验使用的土壤于2021年2月从陕西杨凌草地1.5–2.5米深处采集。选择此底土是为了减少背景生物活性、残留肥料和表土微生物遗留，从而能够在不同植物密度和功能群处理下更受控地评估土壤功能。土壤根据联合国粮农组织分类被归类为Anthrosol，质地为粉砂粘壤土。土壤风干后过8毫米筛并均质化用于盆栽实验。土壤pH为8.46，SOC为4.46克/千克，总氮（TN）为0.72克/千克，铵（NH₄⁺）为1.02毫克/千克，硝酸盐（NO₃^–）为10.73毫克/千克，总磷（TP）为0.75克/千克，有效磷（OP）为7.69毫克/千克。

实验涉及16种植物物种，根据其生态功能分为四个PFGs（C₃禾草、C₄禾草、草本植物和豆科植物），以及六个种植密度水平（1、2、4、8、12和16点/盆）。在每个PFG内，选择了四个代表性植物物种以捕捉组内自然变异。然而，物种身份未被作为独立处理因子。每个物种以单作形式生长，每个物种×密度组合构成一个独立实验单元，具有两个生物学重复（n = 2）。结果在功能群水平上解释，物种身份被视为变异性来源而非重复，从而避免伪重复并确保稳健推断。C₃禾草为羊草、黑麦草、无芒雀麦和披碱草。C₄禾草为柳枝稷、狼尾草、狗尾草和画眉草。草本植物为鬼针草、三叶鬼针草、豚草和豚草。豆科植物包括紫花苜蓿、黄芪、白三叶和驴食草。大多数这些植物物种（除豚草外）常见于中国北方的天然草地。这些植物物种的种子来自河南大学生命科学学院的生物相互作用与生物安全实验室以及当地商业供应商。总共准备了192个盆。

实验在带有可移动防雨棚的露天环境中进行。2021年3月3日，我们将2.7千克干土壤填入实验盆（顶部直径16厘米，底部直径12.5厘米，高度17厘米），对应容重为1.2克/立方厘米。每个植物物种的种子根据种植密度（1、2、4、8、12和16点/盆）均匀播种，每点4粒种子。种植前将土壤湿度调整至持水量（WHC）的70%。实验期间每天称重并浇水以维持土壤湿度在70% WHC。生长1-2周后，间苗至每点两株幼苗。如果某点少于两株幼苗，则从备用盆移植幼苗以弥补差异。

生长6个月后，从每个盆收集植物和土壤样品。植物在土壤表面以上1厘米处切割以测量地上生物量（AGB），以避免植物组织被土壤颗粒污染并确保所有盆的一致性。将整个土壤体（包括根系）小心从盆中取出，并从盆中部收集无根整体土壤。轻轻摇动根系以去除松散附着的土壤后，将紧密附着在根系上的土壤仔细刷下并收集为根际土壤。根际土壤收集后剩余的根系被视为地下生物量（BGB）。地下植物样品用自来水冲洗，地上和地下样品均在105°C下烘干0.5小时，然后在70°C下烘干直至重量稳定（2-3天）。根冠比通过每盆根重除以茎重计算。每盆的根际和整体土壤分别通过2毫米筛筛分均质化，然后分为四个子样品：一个立即用于土壤N矿化速率分析，一个在4°C下储存用于有效养分（如NH₄⁺、NO₃^–）分析，一个风干并通过0.25毫米筛用于其他化学性质（如SOC、TN、TP、OP）分析，一个在-20°C下储存用于土壤胞外酶活性分析。

土壤理化性质采用Kong等人（2022a）描述的标准方法测量。土壤湿度通过在105°C下烘箱干燥土壤24小时测量。SOC和TN浓度分别使用Walkley-Black方法和凯氏定氮法测量。TP浓度在硫酸和高氯酸湿消化后比色测量，而OP浓度使用Olsen法测量。土壤pH在土水提取物（1:2.5）中用pH计（Mettler Toledo, Germany）测量。

六种土壤胞外酶（C、N和P循环）的活性使用微孔板尺度荧光法测量，使用高荧光化合物7-氨基-4-甲基香豆素和4-甲基伞形酮。每种酶测定的底物和孵育时间见补充表S2。分析中包含的C获取酶包括β-1,4-葡萄糖苷酶（BG）、1,4-β-D-纤维二糖水解酶（CBH）和β-木糖苷酶（BX），而N获取酶为β-1,4-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（NAG）和L-亮氨酸氨基肽酶（LAP）。P获取酶为碱性磷酸酶（ALP）。

土壤中氨基糖的浓度使用Zhang和Amelung（1996）描述的经典气相色谱法测量。分析中包含的氨基糖为葡糖胺（GlcN）和胞壁酸（MurA）。MurA仅来源于细菌细胞壁，被用作细菌残体C的特异性生物标志物，而GlcN来源于真菌和细菌细胞壁。因此，土壤中真菌（FNC）和细菌残体碳（BNC）浓度分别基于GlcN和MurA浓度量化。它们使用方程1和2计算。其中179.17和251.23分别是GlcN和MurA的分子量，9和45分别是GlcN到FNC和MurA到BNC的转换因子。

将土壤样品（16克）放入100毫升聚乙烯瓶中，浇水至70% WHC。然后将瓶子紧密盖紧并在28°C下孵育28天。孵育期间，每4天打开瓶子1小时以交换空气并将土壤湿度调整至70% WHC。28天孵育后，测量土壤矿质N。孵育前土壤中的矿质N浓度也进行了测量。土壤NO₃^–和NH₄⁺通过将土壤（16克）与80毫升2摩尔/升KCl混合提取，并使用自动分析仪AA3（SEAL Analytical, Norderstedt, Germany）测量。净N氨化速率（Ra）、硝化速率（Rn）和矿化速率（Rm）分别使用方程3-5计算。其中NH₄⁺_i和NO₃^?_i分别是孵育前NH₄⁺和NO₃^?的浓度，NH₄⁺_i+1和NO₃^?_i+1分别是孵育后NH₄⁺和NO₃^?的浓度，T是孵育期天数。

基于土壤功能的标准化Z分数评估土壤生态系统多功能性。此计算中使用的指标包括SOC、TN、TP、OP、NH₄⁺、NO₃^–、C:N比、C:P比、N:P比、土壤C、N和P获取酶活性、微生物残体C（FNC、BNC和FNC:BNC比）和N矿化速率（Ra、Rn和Rm）。多功能性指数（MFI）使用multifunc包计算。对所有样品（包括整体和根际土壤）进行Z分数标准化以确保功能间的可比性。所有功能在平均方法中权重相等。由于多重共线性，未移除任何指标，因为MFI是描述性指标，旨在反映生态系统的整体功能性能而非作为预测模型。因此，它对多重共线性不敏感。

使用三向ANOVA模型检验种植密度（1、2、4、8、12和16点/盆）、功能群（C₃禾草、C₄禾草、草本植物和豆科植物）和采样位置（根际和整体土壤）对SOC和土壤养分、植物生物量、根冠比、土壤胞外酶活性、微生物残体C、N矿化速率和MFI的直接和交互效应。对于根际和整体土壤内的单独分析，使用双向ANOVA模型评估种植密度、功能群以及这两个因子的交互作用对同一组变量的影响。使用简单线性或对数拟合阐明植物和土壤指标与种植密度或生物量在不同功能群中的关系。为比较不同功能群效应的相对强度，估计了系数的95%置信区间（CI）。当回归系数的95% CI不重叠时，认为差异显著。使用Tukey-Kramer HSD检验进行整体或根际土壤中不同功能群均值的事后比较。使用Pearson相关系数（r）评估所有指标（包括植物相关和土壤功能指标）之间的成对线性相关性。使用JMP 10.0（SAS Institute, Cary, USA）和R软件包（版本4.3.1）进行统计分析。

结果

3.1 PFGs和种植密度对植物生物量和土壤养分的影响

PFGs和种植密度直接影响AGB和BGB。当在所有种植密度上平均时，草本植物的AGB显著大于C₃禾草、C₄禾草和豆科植物。C₃禾草、C₄禾草和草本植物的BGB显著大于豆科植物。AGB和BGB倾向于随着种植密度增加而对数增加，几乎适用于所有功能群。在四个功能群中，豆科植物具有种植密度与AGB关系的最大系数，但种植密度与BGB关系的最小系数。种植密度对根冠比的影响随PFGs变化。豆科植物的根冠比下降，而C₃禾草的根冠比随着植物密度增加而增加。

PFGs和种植密度也直接影响SOC和几乎所有土壤养分的浓度。整体和根际土壤中的SOC、OP和NO₃^–浓度在豆科植物中显著大于C₃禾草。豆科植物和草本植物具有相似的土壤OP和NH₄⁺浓度，而C₃和C₄禾草具有相似的SOC、TP和OP浓度。

随着种植密度增加，整体土壤中的SOC、TN和NH₄⁺浓度呈现对数增加趋势，而NO₃^–浓度在所有功能群中呈现下降趋势，尽管这些模式并非全部统计显著。C₃禾草的TP浓度在整体土壤中随着种植密度增加显著下降，但在根际土壤中增加，但此趋势未在其他PFGs中看到。此外，土壤养分变化与植物生物量显著相关。例如，TN和NO₃^–与AGB、BGB和根冠比相关。

3.2 PFGs和种植密度对土壤胞外酶活性的影响

PFGs对土壤胞外酶活性的影响随位置变化。当在所有种植密度上平均时，整体土壤中的土壤胞外酶活性在草本植物中显著高于其他功能群，而根际土壤中的活性在草本植物、C₄禾草和豆科植物中高于C₃禾草。整体和根际土壤中的大多数胞外酶活性随着种植密度增加而显著增加。对于草本植物的整体土壤，种植密度与C和P获取酶关系的系数最大，而与N获取酶关系的系数最小。在C₃禾草的根际土壤中，密度与酶活性关系的斜率在所有酶类型中最大。此外，土壤胞外酶活性与SOC和TN浓度显著正相关，但与NO₃^–浓度负相关。

3.3 PFGs和种植密度对微生物残体碳的影响

土壤微生物残体C（即FNC和BNC）受PFGs显著影响但不受种植密度影响，其对PFGs的响应随位置变化。整体土壤中的FNC浓度在C₃禾草中最高，在C₄禾草中最低，而根际土壤中的FNC浓度在草本植物中最高，在C₄禾草中最低。整体和根际土壤中的BNC浓度在C₃和C₄禾草中显著高于草本植物和豆科植物。整体和根际土壤中的FNC:BNC比在草本植物和豆科植物中显著高于C₄禾草。此外，草本植物和豆科植物根际土壤中的微生物残体C以FNC为主，而C₃和C₄禾草根际土壤以及所有四个功能群的整体土壤中以BNC为主。

3.4 PFGs和种植密度对土壤N矿化的影响

当在PFGs和种植密度上平均时，Ra在整体土壤中显著高于根际土壤。相反，Rn和Rm在整体和根际土壤之间相似。整体土壤中的Ra不受PFGs影响，而根际土壤中的Ra在草本植物和豆科植物中显著高于C₃禾草。Rn和Rm在豆科植物中显著高于其他三个PFGs，在整体和根际土壤中皆如此。种植密度对N矿化速率的影响最小。Ra并未随着种植密度增加而显著变化，适用于所有四个PFGs。相反，种植密度对Rn和Rm的影响随PFGs变化。Rn和Rm随着种植密度增加而下降，适用于草本植物的整体和根际土壤，而其他三个PFGs的Rn和Rm不受种植密度影响。

Ra与土壤OP浓度显著正相关，但与TN和NH₄⁺浓度、C和N获取酶活性以及BNC负相关。Rn和Rm与SOC和TN浓度正相关，但与P获取酶活性负相关。此外，草本植物整体和根际土壤中的Rn和Rm与AGB和BGB负相关，而豆科植物的Rn和Rm与AGB和BGB正相关。

3.5 PFGs和种植密度对土壤多功能性的影响

PFGs对MFI的影响随位置变化。当在所有种植密度上平均时，整体土壤中的MFI在草本植物中显著高于其他PFGs，而根际土壤中的MFI在豆科植物中显著高于其他PFGs。此外，MFI随着种植密度增加而线性增加，适用于几乎所有PFGs的整体和根际土壤。在四个PFGs中，豆科植物和草本植物分别具有密度与MFI关系的最大和最小斜率。

讨论

4.1 PFGs对植物生长性能和土壤功能的影响

在PFGs中，草本植物表现出最高的AGB，可能归因于其适应优势。草本植物通常比禾草具有更高的N吸收能力，使它们能够分配更多生物量到叶片并提高对光的竞争力。相反，禾草分配更多生物量到根系以补偿其较低的根蛋白含量和N吸收效率，从而改善探索土壤资源的能力。它们有限的菌根关联可能进一步需要这种直接根系投资。此外，当生长不受养分限制时，草本植物往往比豆科植物对光有更强竞争力，这可能解释了我们结果中草本植物比豆科植物具有更高AGB的原因。草本植物的整体土壤也显示出比其他PFGs更高的胞外酶活性。这可能与草本植物更高的AGB相关。更高的植物生产力通常导致更多SOC输入土壤，从而增强土壤酶活性和微生物生物量C。

在我们的研究中，豆科植物在整体和根际土壤中具有比C₃禾草更高的SOC、OP和NO₃^–浓度。这种模式最可能归因于豆科植物更大的根系沉积和AGB，这不仅为微生物提供C，还促进SOM的微生物分解和养分动员。此外，豆科植物相对其他PFGs较低的BGB可能限制了它们吸收土壤养分的能力。此外，我们的结果还表明豆科植物在整体和根际土壤中表现出比其他PFGs更高的Rn和Rm，与先前研究一致。此结果可能归因于根系沉积的遗留效应刺激微生物矿化过程。因此，豆科植物根际土壤中较高的土壤养分含量和提升的N矿化速率可能有助于其相比其他PFGs增强的土壤多功能性。这可以通过增加的矿化将有机N转化为更易被土壤微生物和植物同化的无机形式来解释，从而促进微生物活性、植物养分吸收和整体土壤生化过程（如有机质分解）。这些过程共同同时改善多个土壤功能，导致豆科植物根际中更大的土壤多功能性。

在本研究中，土壤微生物残体C主要由BNC组成。这可能归因于植物凋落物和根系分泌物大量输入易分解C，刺激快速细菌生长和周转。产生的BNC可以通过与土壤微团聚体和粘土矿物相互作用而稳定化，并变得抗分解。相反，草本植物和豆科植物的根际土壤表现出比C₃和C₄禾草显著更大的FNC和FNC:BNC比。这可能归因于它们的直根系，促进丛枝菌根真菌定殖。同时，C₃和C₄禾草土壤中相对较大的BNC可能归因于根际结构和根鞘，为细菌定殖创造更有利的生态位。

4.2 种植密度对植物生长性能和土壤功能的影响

在本研究中，AGB和BGB随着种植密度增加而对数增加，并在种植密度达到每盆4个点时接近平台水平。在不同PFGs中，豆科植物具有种植密度与AGB关系的最大系数和与BGB关系的最小系数。这表明豆科植物受养分竞争影响较小，但受光资源影响较大，随着种植密度增加。先前研究表明，植物根冠比通常在高种植密度下下降 due to increased stem fraction。然而，我们的结果显示根冠比对种植密度的响应随PFGs变化。例如，C₃禾草的根冠比随着种植密度增加而增加，最可能归因于它们依赖增强的地下生物量分配以满足养分吸收需求。与C₃禾草相反，几个因素有助于缓解土壤养分限制并增加地上生物量分配在其他PFGs中。这些包括C₄禾草的光合途径、草本植物（特别是菊科物种）的生殖特性和适应响应，以及豆科植物与根瘤菌的共生固氮关系。这些特性共同帮助稳定或降低根冠比，随着种植密度增加。

我们的结果表明土壤胞外酶活性随着种植密度增加而增加，在根际和整体土壤中皆如此。这得到先前研究的支持，表明根生物量和根系分泌物量随着更高种植密度增加，为根际和土壤微生物提供底物。此外，增加种植密度可以加剧个体植物间的资源竞争，这可能触发更多植物胞外酶释放以促进有限土壤养分的吸收。在本研究中，草本植物的整体土壤具有种植密度与C和P获取酶关系的最大系数，但与N获取酶关系的最小系数。这表明，随着种植密度增加，与草本植物相关的土壤微生物可能对C和P养分有更强依赖性。草本植物土壤中种植密度与N获取酶关系的小系数可能归因于随着种植密度增加土壤养分变得有限时植物的资源保守策略。此策略以高C和低养分需求为特征，可以减少植物和土壤微生物之间的N竞争。此外，草本植物可能通过根系分泌物释放化感化合物，潜在地减少硝化细菌丰度，改变微生物群落结构，并对土壤N循环产生负面影响。例如，Zhang等人（2023）的一项单独研究表明，豚草（一种草本植物物种）可以通过调节特定微生物（如减少Candidatus Nitrososphaera丰度）来抑制土壤硝化。这可能部分解释为什么草本植物土壤的硝化和矿化速率随着种植密度和生物量增加而下降，在根际和整体土壤中皆如此。然而，这些机制仍是推测性的，需要进一步实验确认。最后，我们发现增加种植密度对土壤多功能性有积极影响，豆科植物在测试的PFGs中效应最大。这可能归因于密度介导的生物量增加与土壤N矿化和硝化正相关。

值得注意的是，植物生物量、土壤胞外酶活性、微生物残体C和土壤多功能性对增加种植密度的响应在PFGs之间并未显著变化。这表明种植密度对这些土壤功能的影响在PFGs之间是一致的，可能归因于更高密度下类似的植物介导资源输入。微生物过程也可能对总体碳和养分输入更敏感，而非PFG的身份。

结论

总的来说，我们的结果表明种植密度和PFGs直接影响土壤功能，且PFGs的效应大于种植密度。鉴于先前研究主要关注植物物种和功能群丰富度对生态系统功能的影响，我们的研究为植物群落变化如何在功能群水平上影响生态系统功能提供了新机制见解。尽管物种身份未被明确建模，但每个功能群包含多个代表性物种增强了我们发现的普适性。本研究在单生长季使用底土在盆中进行，以最小化表层遗留效应并提供受控环境以分离处理效应。虽然此类设计在解释机制方面提供清晰度，但它也可能限制根系发育、微生物复杂性和水文相互作用。未来研究应使用表土将这些发现扩展到田间相关条件，并纳入功能群内的物种水平变异，以更好地理解长期动态和生态意义。