多组学解析小鼠胎盘红系细胞主导MHC II类抗原呈递、趋化因子及抗菌免疫应答基因表达

本研究发现小鼠胎盘中的红系细胞是表达MHC II类抗原呈递、趋化因子及抗菌免疫应答基因的主要群体，通过空间转录组、流式细胞术、转录组和分泌组等多组学技术，揭示了其在妊娠免疫调节中的核心作用，为理解母胎耐受机制提供了新视角。

　　

引言

妊娠是一个复杂的生理过程，需要精确调控的免疫环境以支持胎儿发育并防御感染。母胎之间的主要屏障是胎盘，这一特殊器官中特定免疫细胞群的作用尚未被完全阐明。母胎界面存在着独特的免疫学悖论：母体免疫系统必须同时耐受半同种异体胎儿并维持有效的抗感染免疫防御。成功的妊娠依赖于胎盘这一特殊器官对免疫反应的精确调控。尽管在胎盘生物学理解方面取得了显著进展，母胎界面的免疫调节机制仍有许多未知。比较人类和小鼠胎盘的研究为了解妊娠成功的进化保守和物种特异性机制提供了宝贵见解。小鼠模型还允许使用同一品系小鼠进行同系妊娠，从而消除人类和跨品系小鼠妊娠中发生的抗原特异性反应，使研究人员能够理解此类反应的影响。

人类胎盘是血绒膜型，其特征是滋养层细胞深度侵入母体蜕膜，胎儿组织直接暴露于母体血液。人类滋养层细胞，特别是绒毛外滋养层细胞，在重塑螺旋动脉和与母体免疫细胞相互作用中起主要作用。相比之下，小鼠胎盘虽然也是血绒膜型，但呈现迷路结构，滋养层侵入有限并保留母体内皮层。这些结构差异影响了母胎界面免疫细胞的组成和功能，导致了母胎耐受的不同调节机制。

人类母胎耐受的关键免疫细胞群包括调节性T细胞（Tregs）、M2巨噬细胞、蜕膜自然杀伤细胞（dNK cells）和红系细胞。Tregs通过分泌IL-10和TGF-β1抑制母体抗胎儿免疫反应，尽管其积累和活性在人类和小鼠之间存在差异。M2巨噬细胞通过VEGF和IL-10分泌促进血管生成和免疫抑制，而dNK细胞调节血管重塑和滋养层相互作用。

在小鼠中，红系细胞最近被Elahi及其同事的两项里程碑研究确定为胎盘免疫耐受的潜在调节者。他们的工作表明，红系细胞组成性表达检查点配体PD-L1和精氨酸酶-2（arginase-2），赋予它们双重耐受机制，可抑制效应T细胞活化和细胞因子产生，同时维持母胎界面的组织稳态。功能上，这一程序在鼠胎盘组织内 enforced 了一个效应T细胞贫乏的环境——一个实用的T细胞荒漠，并关键地将免疫景观偏向调节性T细胞分化和维持。将这些以红系细胞为中心的耐受范围扩展到胎盘之外，这组作者还表明，妊娠期间和新生儿期的红系细胞培育了共生肠道微生物群落，揭示了一个协调的、系统水平的免疫调节轴，将胎盘耐受与产后粘膜免疫教育和微生物管理联系起来。他们还表明，使用抗CD71抗体消耗红系细胞会导致妊娠失败，甚至提出“红系细胞在母胎耐受中必不可少”，这可能是因为消除了胎盘和外周组织中的红细胞及其前体，因为CD71是几乎整个红系成熟的重要标志——BFU-E（红系爆式集落形成单位）、CFU-E（红系集落形成单位）、原红细胞、嗜碱性幼红细胞、多染性幼红细胞、正染性幼红细胞和早期网织红细胞。还有研究表明，人类和小鼠红系细胞能够进行细胞因子基因表达和分泌。

鉴于胎盘免疫调节在妊娠结局中的重要性，使用现代转录组学方法在人类和小鼠中继续进行的研究至关重要。理解母胎耐受的细胞和分子机制不仅将增强我们对正常妊娠生理学的认识，还将有助于开发针对妊娠并发症如先兆子痫、复发性流产和胎儿生长受限的治疗策略。为了进一步剖析胎盘免疫调节的复杂性，我们决定使用空间转录组学研究E12.5小鼠胎盘内免疫和非免疫细胞异质性及空间组织的特征，并通过流式细胞术蛋白质组学、NanoString批量转录组学和LegendPlex分泌组学进行鼠胎盘免疫细胞群分析。我们还对人胎盘来源的脐带血红系细胞进行了scRNA-seq，用于种间比较研究。

材料与方法

小鼠胎盘的获取

我们模拟了半同种异体妊娠♀CBA × ♂C57Bl6（n = 19）和同系妊娠♀CBA × ♂CBA（n = 19）以获得小鼠胎盘。将一只雄性和一只适当遗传品系的雌性共笼饲养。小鼠购自细胞学与遗传学研究所（新西伯利亚，俄罗斯）的动物房。小鼠在正常的动物房条件下饲养，自由获取水和食物，处于自然的昼夜周期中。妊娠的开始通过雌性出现阴道栓来确定。在小鼠交配后第12-13天（E12.5，每种妊娠类型n = 11）和第19-20天（E19.5，每种妊娠类型n = 8）实施安乐死并收集胎儿和胎盘。怀孕小鼠通过颈椎脱位法实施安乐死。

对怀孕小鼠实施安乐死后，我们在无菌条件下打开腹腔，小心取出胎儿连同胎盘。然后将部分胎儿-胎盘复合物转移到冷冻模具中（每种妊娠类型在E12.5时n = 3），其余的用于提取胎盘单核细胞（在E12.5和E19.5时，每种妊娠类型n = 8）。

小鼠胎盘的冷冻切片

我们将胎儿与胎盘在-20°C的OCT组织冷冻液中冷冻，在冷冻切片机上以10 μm厚度切片，并将所得切片转移到Poly-Prep Slides上用于新鲜冷冻切片。然后立即使用获得的切片在CytAssist仪器上制备10X Genomics Visium空间转录组学文库。由于CytAssist仪器一次只能处理两个样本，我们总是同时处理一个半同种异体和一个同系胎儿-胎盘切片以去除批次效应。

小鼠胎盘单核细胞的分离

为了分析胎盘细胞群，我们将胎儿与胎盘转移到无菌培养皿中，在那里将胎儿与胎盘分离。将分离的胎盘放入含有冷的含抗生素的RPMI-1640培养基的无菌玻璃小瓶中。每只小鼠的胎盘被合并。通过将整个胎盘在玻璃匀浆器中于3-5 mL PBS中匀浆来分离胎盘细胞。将细胞悬液在5-10 mL PBS中洗涤后，我们在Ficoll-Urografin密度梯度（密度=1.119 g/ml）中离心胎盘细胞30分钟，RCF 322，并在PBS中洗涤两次。

胎盘Ter-119⁺红系细胞的磁珠分选

我们使用生物素化的抗Ter-119抗体和链霉亲和素偶联的磁珠对所有实验（除了空间转录组学和流式细胞术分析）进行了小鼠胎盘单核细胞的磁珠分选。

胎盘Ter-119⁺红系细胞的活力染色

我们根据制造商方案使用台盼蓝在Countess 3自动细胞计数器上测量了胎盘Ter-119⁺红系细胞的活力。台盼蓝染色显示分选的红系细胞活力>98%。

小鼠胎盘的空间转录组学分析

10X Genomics Visium空间转录组学文库的制备

我们根据Visium CytAssist新鲜冷冻空间基因表达的制造商说明进行了小鼠胎盘的文库制备。

通过CoexpressDeconvolve对10X Visium数据进行单细胞水平反卷积

我们使用CoexpressDeconvolve对10X Visium数据进行了单细胞状态深度反卷积。简而言之，CoexpressDeconvolve使用市场交换格式的基因表达矩阵，通过二值化基因UMI计数、计算Pearson相关系数并通过从1中减去它们将其转换为距离值来计算基因x基因距离矩阵。然后它使用分辨率为1.5的层次聚类算法识别基于距离的基因簇。选择1.5的分辨率是因为它清楚地分离了小鼠胎儿-胎盘复合物中的所有主要细胞类型。对于每个基于距离的基因簇，管道拟合负二项分布并应用85百分位分布阈值来识别空间点内的簇。为了估计细胞计数，计算每个基于距离的簇的最小UMI总和，并将每个距离簇每个点的UMI总和除以距离簇UMI总和最小值。使用此信息，管道根据其基因表达谱将空间转录组点反卷积为距离簇，并进一步将这些距离簇反卷积为推定的单细胞。最后，它在原始空间点位置内随机分配推定的细胞，并生成基因表达、细胞位置和细胞簇输出文件。

在Seurat中对单细胞反卷积的小鼠胎盘进行空间转录组学分析

我们将来自CoexpressDeconvolve的基因表达、细胞位置和细胞簇输出文件导入Seurat，执行对数标准化，通过GSEApy使用距离簇基因进行簇识别，使用SpatialDimPlot()和SpatialFeaturePlot()创建空间表达图，找到每个簇的顶级基因，并通过DotPlot()函数创建基因的点图。

胎盘单核细胞的流式细胞术分析

细胞染色和流式细胞术数据采集

我们洗涤1-2×10⁶个胎盘单核细胞，并用抗体染色。对于流式细胞术蛋白质组学分析，我们使用了以下抗体。在黑暗中孵育细胞30-40分钟后，用0.5 ml补充有0.09% NaN₃的PBS洗涤它们。流式细胞术在Attune NxT流式细胞仪上进行。

流式细胞术数据分析

为了分析胎盘的细胞组成，我们首先圈门细胞并去除双联体，并收集了CD4 T细胞、CD8 T细胞、单核细胞、有核红系细胞和有网红细胞在胎盘单核细胞中的百分比数据。我们使用GraphPad Prism 10.2.3中的双因素方差分析和Tukey多重检验校正进行统计分析，认为q值<0.005具有统计学意义。我们还使用GraphPad Prism 10.2.3生成细胞簇百分比的点图。

胎盘Ter-119⁺红系细胞的NanoString基因表达分析

从小鼠胎盘Ter-119⁺红系细胞中分离总RNA

使用Total RNA Purification Plus Kit，我们从500,000个Ter-119磁珠分选的胎盘红系细胞中分离总RNA。我们使用Qubit 4荧光计测量每个样品的总RNA浓度。然后将RNA在-80°C冷冻直至基因表达分析。

使用NanoString Sprint对小鼠胎盘Ter-119⁺红系细胞进行免疫转录组分析

我们使用NanoString nCounter Sprint Profiler Assay System进行了胎盘红系细胞的免疫转录组表达分析。我们使用了来自每个胎盘红系细胞样品的200 ng总RNA和nCounter Mouse Immunology v1 panel。我们将总RNA样品进行20小时杂交反应。探针与目标分子杂交后，我们使用NanoString nCounter Sprint确定目标分子的数量。

我们在nSolver 4软件中进行了归一化和质量控制，考虑了添加的合成阳性对照和面板中包含的看家基因的表达。我们通过去除未表达的基因来过滤基因表达矩阵。我们将表达数据进行了log2转换，并将表达阈值定义为确定的探针拷贝数转换后归一化值的中位数。我们移除了在所有样品中低于表达阈值的基因。

小鼠胎盘Ter-119⁺红系细胞的基因表达分析

为了研究胎盘红系细胞的免疫调节特性，我们分析了胎盘红系细胞以及M1和M2巨噬细胞的基因表达谱。我们从Gene Expression Omnibus数据库下载了M1和M2巨噬细胞的原始探针计数数据。我们利用PyDESeq2进行基因表达分析。我们使用中位数比率法对原始探针计数进行归一化，并进行了差异基因表达。我们认为q值<0.001且log2(倍数变化)>1.0或log2(倍数变化)<-1.0的基因为差异表达基因。为了可视化基因表达，我们通过bioinfokit生成了热图。我们通过GSEApy对胎盘红系细胞表达的基因进行了基因集富集分析。

小鼠胎盘Ter-119⁺红系细胞的LegendPlex分泌组分析

从小鼠胎盘培养Ter-119⁺红系细胞

我们将磁珠分选的Ter-119⁺胎盘红系细胞在无血清的X-VIVO 10培养基中培养24小时。培养24小时后，我们通过离心将条件培养基与细胞分离。将条件培养基转移到新的0.2 μl管中，并在-80°C冷冻直至细胞因子定量。

使用LegendPlex分析小鼠胎盘Ter-119⁺红系细胞的分泌组

我们使用LEGENDplex?多重免疫分析法分析了来自小鼠胎盘Ter-119⁺红系细胞的条件培养基中的细胞因子和趋化因子水平。我们根据制造商的建议进行了测定。简而言之，我们将条件培养基样品和标准品与珠子在96孔板中孵育2小时。然后，我们加入生物素化的检测抗体，并将混合物孵育1小时。之后，我们向孔中加入链霉亲和素结合的荧光染料抗体，进行最终30分钟的孵育，然后洗涤样品以去除未结合的成分。我们在Attune NxT流式细胞仪上读取荧光信号。然后我们使用LEGENDplex?数据分析软件处理数据。

为了分析差异细胞因子产生，我们在BulkOmicsTools中进行了多重t检验和错误发现率多重检验校正。我们认为Log2(倍数变化)>2.0或log2(倍数变化)<-2.0且q值<0.01具有统计学意义。

细菌生长抑制试验

为了评估鼠妊娠期间红系细胞分泌因子的抗菌活性，我们使用了在E12.5和E19.5两种妊娠类型中从胎盘红系细胞收集的条件培养基。我们使用大肠杆菌NebStable菌株进行了细菌生长抑制试验。将细菌在LB肉汤中过夜培养，稀释至初始OD600为0.05，并与红系细胞条件培养基混合。我们使用含有细菌的LB肉汤作为阳性对照，补充有50 μg/mL卡那霉素的含有细菌的LBB作为阴性对照，以及不含细菌的LBB作为空白。我们以双份进行测定。使用Varioskan Lux酶标仪每15分钟测量一次595 nm处的吸光度，持续18小时。整个实验过程中，板保持在30°C并持续以60 rpm振荡。

单人胎盘来源脐带血CD235a⁺红系细胞的分析

人脐带血CD235a⁺红系细胞的磁珠分选

我们从“Bank Stvolovih Kletok” LLC获得储存在10% DMSO和90% FBS中的脐带血样品。我们解冻储存在液氮中的脐带血样品，并通过密度梯度离心分离脐带血单核细胞。我们根据制造商的方案使用抗CD235a微珠进行脐带血单核细胞的磁珠分选。

BD Rhapsody文库制备

我们将磁珠分选的红系细胞与BD Rhapsody系统的Sample Tag分子条形码抗体在室温下孵育20分钟，然后用冷的样品缓冲液洗涤三次。洗涤循环后，我们使用钙黄绿素细胞染色和Attune NxT流式细胞仪计数脐带血红系细胞。我们将等量的细胞合并，重新悬浮在冷的样品缓冲液中至最终浓度20细胞/μl，并将其加载到BD Rhapsody cartridge上。我们使用InCell Analyzer 6000评估细胞加载质量。

我们使用BD Rhapsody Express单细胞分析系统进行单细胞捕获和cDNA文库制备。简而言之，我们使用Immune Response primer panel在10个PCR循环中扩增cDNA。我们使用AMPure XP磁珠纯化得到的PCR1产物，并根据扩增子大小从Sample Tag文库中分离Immune Response panel文库扩增子。

接下来，我们对纯化的PCR1 Immune Response panel文库产物和Sample Tag PCR1文库产物分别在10个半巢式PCR循环中进行扩增。我们通过双向选择使用AMPure XP珠子纯化得到的PCR2产物。我们使用Qubit 4.0估计最终文库的浓度。我们将最终PCR产物归一化，并使用Illumina测序仪的索引引物进行最终一轮扩增以制备最终文库。我们在Qsep 1毛细管电泳仪上进行文库QC。

我们将最终文库以Immune Response panel/Sample Tag文库比例约94%/6%混合，旨在每个细胞达到约10,000和600 reads，最终浓度为5 nM。我们在NextSeq 550测序仪上对混合文库进行测序。

原始测序数据分析

我们使用BD Rhapsody v1.9管道处理测序产生的原始FASTQ文件。该管道首先根据读长、平均碱基质量得分和最高单核苷酸频率去除低质量读对；然后分析剩余的高质量R1读段以识别细胞标签和UMI序列；并使用Bowtie2将剩余的高质量R2读段与mRNA参考panel序列比对。然后，管道将具有共同细胞标签、UMI和基因的读段折叠成独特的转录本分子。所得计数使用错误校正算法进行调整。然后管道使用二阶导数分析将细胞与噪音分离。然后管道使用Sample Tag信息对样品进行解复用并去除多重体。管道从人脐带血中检测到9,615个红系细胞。

免疫转录组表达分析

我们将获得的脐带血红系细胞的基因表达矩阵提交给我们已建立的红系细胞分析Seurat流程，我们执行了质量控制和SCTransform数据归一化，对归一化数据进行了PCA降维，执行了Harmony批次校正和整合，使用20个Harmony校正的主成分进行UMAP降维，并找到了单细胞邻居和簇。

然后我们鉴定了对应于红系细胞后续分化阶段的红系细胞簇。我们使用PrepSCTFindMarkers()函数准备SCT标记用于差异基因表达测试，并使用Wilcoxon符号秩检验进行簇间差异基因表达。我们使用FindMarkers()函数将生物学和统计学显著性标准设置为log2(倍数变化)>1.0或log2(倍数变化)<-1.0且q值<0.005。我们使用差异表达的ALAS2、CD36和ITGA4基因鉴定簇。ALAS2、SCL25A37和SCNA基因的表达从原红细胞阶段开始逐渐增加，而CD36和ITGA4基因的表达从原红细胞阶段开始逐渐减少。我们发现ARG1⁺红系细胞具有独特的ARG1基因表达。此外，我们检测到一小群红系细胞亚群——DEFA3+红系细胞，它们具有DEFA3基因表达。最后，我们使用Seurat中的DotPlot生成了差异表达基因的点图。

为了比较人脐带血和小鼠胎盘红系细胞之间的基因表达，我们汇总了每个scRNA-seq样品的每个样本的UMI计数，将小鼠基因名转换为人基因名，使用中位数比率法对NanoString和汇总的scRNA-seq样品的原始探针计数进行归一化，执行基于log2的数据转换，并执行Z-score数据标准化。我们通过bioinfokit使用热图可视化基因表达。我们还执行了R²计算，以通过Pandas corr函数可视化人脐带血和小鼠胎盘红系细胞之间的基因表达差异，并通过Matplotlib可视化基因表达。

结果

红系细胞是小鼠胎盘中最常见的免疫调节细胞

为了研究小鼠胎盘中的免疫群体，我们对来自半同种异体和同系妊娠的E12.5小鼠胎盘进行了空间转录组学分析。首先，我们通过CoexpressDeconvolve进行了空间数据的单细胞水平反卷积和单细胞簇鉴定。我们观察到，红系细胞是鼠胎盘中唯一可检测到的免疫调节细胞群。我们还观察到红系细胞形成独特的生态位，存在于胎盘的所有层中：蜕膜、连接带和迷路层，并表达胎儿和正常血红蛋白，这表明存在胎儿和母体红系细胞。

然后我们使用流式细胞术研究小鼠胎盘中的免疫细胞群。我们观察到Ter-119⁺红系细胞确实是胎盘单核细胞中的主要细胞群，从而证实了我们在E12.5的空间转录组学数据——红系细胞在同系妊娠中平均占胎盘单核细胞的88.5±2.0%，在半同种异体妊娠中占78.5±6.3%。我们还观察到E19.5标志着胎盘红系细胞百分比的显著下降——它们平均占胎盘单核细胞的43.1±4.8%，与妊娠类型无关。其他免疫细胞类型占胎盘单核细胞的2.1±2.4%，从而验证了我们的空间转录组学发现。

小鼠胎盘红系细胞表达涉及免疫抑制、MHC II类抗原呈递、免疫细胞趋化性和抗菌免疫的基因

由于Ter-119⁺红系细胞确实在E12.5和E19.5的半同种异体和同系妊娠小鼠胎盘单核细胞中过度存在，我们接下来对胎盘Ter-119⁺红系细胞进行了阳性磁珠分选，随后通过NanoString进行了它们的免疫转录组分析。我们的基因表达分析显示，E12.5的小鼠胎盘红系细胞在两种妊娠类型中具有相同的转录组谱，并且它们表达了大量的免疫调节基因，包括PD-L1、MHC II类抗原呈递基因，以及细胞因子和趋化因子基因。

然后我们对E12.5小鼠胎盘红系细胞表达的基因进行了基因本体论富集分析，并确定了几个显著富集的通路，包括TGF-β受体信号通路和对脂多糖的反应，这可能表明小鼠胎盘红系细胞具有作为抗菌保护者和免疫耐受诱导者的双重作用。

为了比较不同妊娠阶段胎盘红系细胞的转录谱，我们比较了来自半同种异体和同系妊娠的E12.5和E19.5小鼠胎盘红系细胞。基因表达谱的主成分分析揭示了E12.5和E19.5红系细胞之间显著的转录差异。值得注意的是，E19.5胎盘红系细胞根据妊娠类型聚类，表明这些细胞可能获得不同的转录谱。

小鼠胎盘红系细胞的差异基因表达分析显示，E19.5同系妊娠红系细胞表达与炎症和抗菌反应相关的基因。相比之下，在半同种异体妊娠的E19.5红系细胞中上调的基因涉及通过TGF-β信号通路的调节。

为了探索小鼠胎盘红系细胞的整体免疫调节极化状态，我们分析了M1和M2巨噬细胞的基因表达谱以及来自E12.5和E19.5胎盘的