实验性慢性肾病中骨髓脂肪组织扩张与骨丢失独立于骨髓基质细胞谱系决定的改变

本研究发现，在实验性慢性肾病（CKD）模型中，骨髓脂肪组织（BMAT）的扩张与骨丢失现象并不依赖于骨髓基质细胞（BMSC）向成脂（APC）或成骨（OPC）谱系分化的改变。研究通过μCT、流式细胞术和基因表达分析揭示了BMAT积累与骨微结构破坏的时空关系，并排除了瘦素缺乏或糖皮质激素过度的驱动作用，为CKD相关骨病（ROD）的机制提供了新视角。

　　

引言：慢性肾病-矿物质骨障碍（CKD-MBD）是一种不可逆的肾功能丧失疾病，导致矿物质稳态改变和骨丢失，通常称为肾性骨营养不良（ROD）。骨髓脂肪组织（BMAT）在临床CKD和动物模型中积累，但其机制尚不明确。本研究旨在确定BMAT分布与骨结构的关系，并探讨疾病进展是否直接影响：1）骨髓间充质基质细胞（BMSC）向成骨祖细胞（OPC）和成脂祖细胞（APC）的定向；2）BMSC向成熟脂肪细胞和成骨细胞的分化。

材料与方法：研究使用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，通过饲喂0.2%腺嘌呤饮食≤5周诱导CKD，对照组饲喂无腺嘌呤相同饮食。血清生物化学通过生化分析仪量化，血浆激素水平通过ELISA测定。骨表型通过μCT评估，同一骨骼经脱钙后用1%四氧化锇染色，BMAT通过μCT量化。骨髓前体细胞群体通过流式细胞术量化。

结果：疾病早期CKD的发展通过血清尿素氮和肌酐浓度升高从3周诱导期得到确认。诱导5周后，小梁骨微结构包括骨矿物密度（BMD）受损，而皮质骨面积和厚度在诱导3周和5周后于CKD胫骨中减少。与年龄匹配对照组相比，CKD小鼠近端胫骨BMAT在诱导3周时呈增加趋势，5周时达到统计学显著性，且调节性BMAT积累与小梁骨丢失呈负相关。BMAT积累并非由于热量缺乏，与循环脂联素呈正相关，但与瘦素或皮质酮无关。在CKD发病期（1-2周），CKD小鼠的BMSC具有增强的成脂潜能，但骨髓内OPC和APC比例未改变。

结论：在实验性CKD中，BMAT扩张取决于CKD持续时间，似乎不由低瘦素血症或高皮质酮血症驱动，也不由CKD发病期间前体细胞分化的改变所驱动。

CKD小鼠模型中疾病进展的验证：通过饲喂腺嘌呤饮食的小鼠验证了CKD表型的时间发展。CKD小鼠体重从诱导3周起下降， coinciding with gWAT和iWAT脂肪库的减少。诱导1周后，血清肌酐、BUN、FGF-23和PTH在对照组和腺嘌呤饲喂小鼠中相似，但诱导3或5周后这些分析物在CKD小鼠中增加。这些数据确认了实验小鼠中CKD的时间发展，表明在此模型中“CKD发病”和“CKD早期阶段”分别发生在诱导1-2周和3-5周后。

CKD小鼠皮质和小梁骨结构受损：研究接下来调查了CKD持续时间如何影响皮质和小梁骨结构。在CKD小鼠中，皮质骨面积在诱导3周后于近端胫骨减少，但诱导5周后近端和远端骨的骨面积均减少。皮质变薄在CKD小鼠远端胫骨最为明显，而MMI max和min以及极惯性矩（J）在CKD小鼠近端胫骨减少。诱导1周后未注意到CKD与对照的差异。小梁骨室的变化仅在诱导5周后观察到。与年龄匹配对照组相比，骨体积分数和小梁BMD、厚度、数量和连接密度在诱导5周后的CKD小鼠中均减少。

CKD小鼠皮质骨中Osterix表达减少：在皮质骨中，Runx2表达未改变，而Sp7在诱导3周和5周后减少。Alpl、Tnfrsf11b和Tnfsf11在对照和CKD皮质骨的所有疾病进展阶段表达相似，仅Alpl表现出微弱的时间依赖性变异。Tnfsf11/Tnfrsf11b比率在诱导1、3和5周后的对照和CKD皮质骨中相似。

CKD小鼠BMAT积累增加：为确定CKD小鼠骨结构改变是否与BMAT积累和分布变化相关，接下来通过μCT图像量化了沿胫骨长度的BMAT。诱导5周后，CKD小鼠的rBMAT在近端胫骨增加（约胫骨长度10-48%区域）。类似地，cBMAT在诱导3周和5周后分别于胫骨长度约65-82%和52-78%区域增加。接下来确定了小梁室内BMAT积累是否以 juxtaposed 骨形成为代价。诱导3周后CKD小鼠未注意到小梁骨结构差异；此时存在增加的组成性和总BMAT以及rBMAT增加趋势。相关性分析揭示了诱导5周后rBMAT与小梁骨体积分数之间的 inverse 关系，但早期时间点未出现。这些结果表明rBMAT积累倾向于发生在小梁骨丢失之前，且在CKD早期阶段rBMAT积累与小梁骨丢失之间存在负相关。

激素变化及其与BMAT的相关性：在热量限制（CR）期间，循环脂联素、瘦素和糖皮质激素的变化被提出作为BMAT扩张的后果或原因；因此，在CKD模型中测试了这些关系。CKD小鼠血浆脂联素水平以时间依赖性方式增加，在诱导3周和5周后高于年龄匹配对照组。相反，CKD小鼠血浆瘦素或皮质酮浓度在所有研究年龄均低于或高于对照组。这些结果表明增加的脂联素与CKD的其他持续时间依赖性效应相关，包括对BMAT的影响，而瘦素和皮质酮的变化先于这些其他CKD效应。为测试这些关系，确定了对照和CKD小鼠中rBMAT积累与血浆脂联素、瘦素和皮质酮水平的相关性。这揭示了循环脂联素与rBMAT积累呈正相关，而循环瘦素和皮质酮则未相关。

CKD中BMAT积累并非由于热量限制：CKD小鼠改变的激素谱与CR中观察到的相似。因此，为确定CKD小鼠中增加的BMAT是否可能由CR而非CKD本身引起，进行了配对饲喂实验。自由采食CKD饮食的小鼠消耗少于自由采食对照饮食的小鼠，这种食物摄入差异反映在它们的体重中。为防止 excessive, pathological 体重减轻，所有小鼠在第1周和第2周结束时自由获取补充凝胶饮食48小时。CKD小鼠比配对饲喂小鼠失去更多体重，尽管在研究3周内热量摄入相似，表明CKD具有超出CR单独解释的效应。一致地，BMAT积累在对照和配对饲喂小鼠之间相似，但在CKD小鼠中大于任一这些组。这些结果表明BMAT积累是CKD进展的后果，而非CR本身。

CKD小鼠骨髓组织中基因表达改变：为调查骨髓祖细胞命运在CKD小鼠中是否改变，接下来评估了对照和CKD小鼠骨髓组织中关键转录因子和表型特异性基因的表达。对于成脂标志物，CKD对Pparg2、Cebpa或Lep表达无影响，而两个其他成熟脂肪细胞标志物Fabp4和Adipoq在疾病进展3周和5周时于CKD小鼠骨髓中显著增加。脂解基因Pnpla2和Lipe表达在对照和CKD骨髓中相似，但倾向于在诱导3周后的CKD小鼠中更高，这种差异对于Lipe表达达到显著性。对于成骨标志物，Runx2、Sp7、Alpl和Tnfrsf11b表达在CKD和对照小鼠骨髓中相似，而Tnfsf11表达在诱导5周后的CKD小鼠中高于年龄匹配对照组。

CKD发病期间脂肪细胞和成骨祖细胞数量未改变：观察到Fabp4和Adipoq表达在CKD骨髓组织中更高，且CKD小鼠中BMAT从诱导3周开始积累，表明在CKD中可能存在向脂肪细胞而非成骨表型的BMSC定向转换， prior to 3周时间点。为探讨这种可能性，使用流式细胞术分析了诱导1周和2周后的对照和CKD小鼠骨髓，以量化BMSC、OPC和APC数量。CKD骨髓中的BMSC群体在诱导1周和2周后从对照水平减少，而OPC和APC比例在CKD和对照骨髓中在两个研究时间点相似。这些结果表明CKD小鼠中BMAT积累不太可能由BMSC定向的事先改变驱动，但1或2周饮食腺嘌呤摄入可能不足以编程BMSC谱系定向的此类变化。

CKD小鼠BMSC中Adipoq和脂肪细胞转录因子表达增加：为进一步探索CKD对BMSC谱系定向的影响，接下来确定了疾病进展是否直接影响BMSC向成熟脂肪细胞和成骨细胞的分化，而非简单地它们向APC或OPC的定向。从饲喂对照或CKD饮食4周的小鼠中分离了原代BMSC，此时CKD诱导的BMAT积累已建立。成脂诱导9天后，对照和CKD小鼠的BMSC具有相似的油红O染色和成脂基因Cebpa、Fabp4、Adipoq和Pparg2表达。相反，当在BMSC培养基中培养时，Cebpa、Fabp4和Adipoq而非Pparg2的表达在CKD细胞中与对照细胞相比上调。这种 incongruity 可能由成脂培养基诱导脂肪细胞基因表达的压倒性能力解释，并 dwarf CKD的任何编程效应。对于成骨分化，在成骨培养基中培养21天后，对照和CKD小鼠的BMSC具有相似的ALP活性和茜素红染色，但Runx2、Alpl、Col1a1和Tnfsf11表达在CKD细胞中与对照细胞相比上调。相反，在BMSC培养基中培养的对照和CKD细胞的成骨基因表达相似。Tnfsf11/Tnfrsf11b基因比率在对照和CKD BMSC cultured in BCM中相似，但在OCM中培养时增加。这些 discrepant 基因表达数据可能是对照和CKD细胞对成骨培养基反应性差异的结果。当然，增加样本数量和更长培养时间可能揭示基因表达以及油红O和茜素红染色的进一步差异。

讨论：广泛认可CKD可导致骨丢失， thereby 增加骨质疏松和骨折风险。骨丢失和血清骨转换标志物增加也在多种CKD-MBD动物模型中注意到，虽然ROD发展的精确机制仍不清楚，但由于持续高PTH水平增加的骨吸收被视为其病因学的中心。然而，其他机制如尿毒症毒素诱导的线粒体异常可能也参与，因为髋部和椎体骨折增加已在低循环PTH患者中报道。本研究发现此CKD小鼠模型中BMAT增加与先前在其他动物模型和人类此疾病中的观察一致。有几种机制通过 which 增加的BMAT可能直接促进CKD中的骨丢失和骨折风险。一种可能性是BMSC从成骨向脂肪细胞谱系定向的转换可能为ROD发展提供额外/替代解释。间充质细胞命运的改变也可能解释骨减少/骨质疏松患者、衰老、肥胖和CR中更高的骨髓脂肪含量。本研究中CKD小鼠中骨量和BMAT之间的 inverse 关系与成人和儿科CKD数据一致。然而，我们的数据也表明BMAT积累先于CKD中的骨丢失。我们显示体重减轻和血清CKD标志物在CKD小鼠中首次在3周后变得明显，此时存在总BMAT积累增加和CKD骨髓组织中Fabp4和Adipoq表达增加，但小梁BMD、BV/TV、数量、厚度或连接性无变化。这些数据确认了BMAT积累与骨丢失之间的复杂关系。虽然成脂生成增加在骨髓基质细胞中和成骨分化减少在CR和衰老中发生，但其他研究报道BMAT积累本身不导致骨丢失。此外，兔子研究披露在CR期间，骨丢失可独立于BMAT积累发生。而且，最近研究 identified 两个 distinct BMSC群体并质疑BMSC向成脂或成骨谱系相互排斥定向。因此，需要更明确实验，可能涉及 exclusively 标记 pre-commitment 细胞群体的可诱导Cre系，例如Cxcl12-CreE。这种方法将允许体内基质细胞群体的可视化。从我们的数据中，可能谱系分化之外的额外因素可能促进CKD中的BMAT积累。然而，我们揭示BMSC比例在CKD发病期间减少，虽然这表明BMSC增殖和/或存活的潜在损伤，需要进一步研究确认。而且，从4周诱导CKD小鼠中原代BMSC向脂肪细胞和成骨表型的分化可能具有洞察力。在BMSC培养基中培养的CKD BMSC中成脂基因表达增加表明对成脂生成的固有 predisposition。这可能归因于CKD小鼠中长期暴露于 altered 系统环境，可能 prime BMSC用于成脂分化。在成骨培养基中培养的CKD BMSC中成骨基因的优先上调表明潜在增强，但可能 dysfunctional，成骨反应。我们发现CKD小鼠中血清脂联素更高镜像人类数据，其中在CKD个体中，它可能作为肾功能障碍的生物标志物。血清脂联素与BMAT体积之间的相关性支持 accumulated BMAT是CKD小鼠中增加脂联素的来源的可能性，如在CR小鼠模型中 noted。一致地，我们显示Adipoq表达在CKD小鼠骨髓内增加。然而，尽管iWAT和gWAT质量在CKD发病期间减少，不能排除WAT由于增加生产和分泌是CKD小鼠中增加循环脂联素的贡献来源。然而，这不太可能，因为在CR中，脂联素表达和从WAT的分泌不增加。无论来源如何，脂联素可能通过自分泌机制促进前脂肪细胞分化，但 whether 这种‘feed-forward’机制促进CKD中的BMAT积累目前不清楚。瘦素由WAT产生，CKD小鼠中循环水平减少可能是食物摄入减少和体脂减少的后果。由于瘦素缺乏ob/ob小鼠呈现增加BMAT和减少BMD，可能低循环瘦素水平促进CKD小鼠中 noted BMAT积累和骨丢失。然而，雌性小鼠中的CR可增加BMAT而不引起低瘦素血症，而雄性兔子的CR导致减少系统瘦素而无BMAT扩张。因此，可能低瘦素血症本身既不必要也不足以促进CKD中的BMAT扩张。除脂肪因子外，细胞因子如RANKL也从BMAds分泌，我们显示Tnfsf11表达而非Tnfrsf11b在CKD小鼠中增加。因此，BMAT衍生RANKL可能也促进这些小鼠中 noted 骨丢失。瘦素水平减少可能负责CKD小鼠中增加循环皮质酮，且此观察与热量限制小鼠和库欣病表型一致，其中糖皮质激素过量可能促进BMAT扩张。仍然不清楚CKD小鼠中增加皮质酮是否促进它们的BMAT积累和/或受损骨健康。确实，我们的配对饲喂研究表明CR本身不负责CKD小鼠中的BMAT积累，表明 underlying BMAT扩张的机制可能在CKD和CR之间不同。

总之，我们通过饲喂腺嘌呤补充饮食最多5周在小鼠中诱导了CKD-MBD。这些小鼠丢失皮质和小梁骨并在骨髓腔内积累脂肪细胞。BMAT积累先于小梁骨丢失并与小梁骨体积分数负相关，表明BMAT积累可能促进CKD中的骨丢失。虽然脂肪细胞和成骨祖细胞数量在CKD发病期间未改变，但来自CKD小鼠的BMSC具有更大成脂标志物表达，表明体内增强的成脂潜能可能促进此疾病中增加的BMAT。这些发现将为未来关于CKD中BMAT积累的原因和后果的研究提供信息，这可能帮助识别涉及的细胞机制并更具体地确定BMAds扩张是否以受损成骨细胞骨形成为代价。此类研究可能 uncover 改进此病症临床管理的策略。