CD8+T细胞与NK细胞稳态互作建立先发免疫监视以清除抗原逃逸肿瘤

本综述深入探讨了CD8+T细胞与自然杀伤（NK）细胞之间的稳态互作机制，揭示了其在建立先发性免疫监视、有效清除肿瘤抗原逃逸变异体中的核心作用。研究通过精巧的动物模型（Rag1?/?）、活细胞成像及信号通路分析，证实早期（D?7）过继性T细胞转移能通过伪足纳米管结构双向交换膜片段（如CD25/CD69），激活STAT/Akt/mTOR等通路，协同增强NK细胞效应功能（CD107a+GzmB+）并促进中央记忆性T细胞（CD62L++CD44++TCM）分化，为新一代预防性免疫疗法奠定理论基础。

　　

Background and objective

肿瘤抗原逃逸变异体通过破坏淋巴细胞效应功能与重塑肿瘤-免疫动态来削弱免疫治疗效果。剖析肿瘤进展过程中免疫网络内部的功能性相互作用至关重要。本研究旨在探究CD8⁺T细胞与自然杀伤（NK）细胞之间的稳态交互作用是否能先发制人地阻止肿瘤抗原逃逸。

Methods

研究在Rag1^?/?和Rag1^?/?γc^?/?小鼠模型中，于肿瘤建立前（D_?7，稳态预 priming）或建立后（D₊₁）进行过继性CD8⁺T细胞转移。通过流式细胞术、活体生物发光及共聚焦成像技术对抗原呈递、免疫活化、增殖、细胞毒性和记忆形成进行量化。采用单培养、共培养以及模拟基底膜拓扑结构的3D二氧化硅纳米纤维毯模型来模拟细胞间相互作用。进行了信号通路阵列和运动指标（速度-距离指数、减速比）分析。并通过硅学（in silico）方法探究了人类参与CD8⁺T-NK细胞对话的配体-受体对。

Results and discussion

研究发现，在肿瘤发生前（D_?7）进行CD8⁺T细胞转移能完全抑制抗原逃逸肿瘤，其中NK细胞作为主要效应细胞，表现出CD25、CD69、CD107a和GzmB的升高，标志着其活化状态和效应表型，并促进了中央记忆性CD62L⁺⁺CD44⁺⁺CD8⁺⁺T_CM前体细胞的生成。相比之下，在肿瘤建立后（D₊₁）进行T细胞转移，尽管这些T细胞本身具有比D_?7组更高的细胞毒性潜能，但仍允许在第25天出现对抗原特异性细胞溶解具有抵抗性的肿瘤变异体。机制上，CD8⁺T细胞与NK细胞通过伪足状细胞间纳米管形成稳定接触，实现双向膜交换并通过STAT、Akt和mTOR通路进行信号传导，从而增强NK细胞效应功能并促进CD8⁺T_CM分化。硅学分析鉴定出人类中参与CD8⁺T-NK细胞粘附、刺激和调控轴的多个配体-受体对，包括CD200-CD200R、PD-L1-PD-1以及CD18/CD11a-DNAM-1 (CD226)。这些数据共同支持了一个由早期CD8⁺T-NK细胞对话启动的先发性免疫监视的三阶段模型。

Conclusion

CD8⁺T细胞与NK细胞之间的稳态条件作用与效应器协同性共同对抗肿瘤免疫逃逸。该发现揭示了一个先发性免疫监视的机制轴，为下一代控制抗原逃逸肿瘤的预防性免疫疗法奠定了基础。

1 Introduction

免疫系统是一个高度动态的特化细胞网络，其功能受复杂的调控反馈回路支配。免疫学的一个关键挑战是理解淋巴细胞相互作用如何在肿瘤侵袭的组织中适应，其中免疫抑制性炎症环境常常破坏抗肿瘤淋巴细胞及瘤内免疫细胞间的交互。尽管有免疫检查点阻断抗体的加持，甚至来自癌症患者的基因工程抗肿瘤T细胞也未能提高大多数恶性肿瘤（白血病和促结缔组织增生性黑色素瘤除外）转移后的5年无复发生存率（<25%）。进一步限制工程化TCR T细胞疗法有效性的问题还包括TCR链错配和产生自身反应性TCR异源二聚体，这可能导致致命的脱靶反应。此外，TCR转导的T细胞以极高的敏感性和特异性识别肿瘤细胞，可能会加速“免疫编辑”肿瘤变异体中的抗原漂变，涉及不同的细胞种系基因。这些固有的安全性风险限制了当前T细胞疗法的效力，并可能危及旨在引发强大抗肿瘤T细胞反应的个性化突变组疫苗的结果。

此外，肿瘤的内源性策略可以塑造疾病进程并促进抗原逃逸变异体的出现，因其缺乏免疫原性而影响T细胞反应，这被认为是“冷”肿瘤细胞用于逃避免疫识别的有效机制。在效应阶段，CD4⁺T淋巴细胞、树突状细胞甚至基质细胞在维持CD8⁺T细胞反应中扮演关键角色。然而，关于CD8⁺T细胞在初始 encounter 期间及效应阶段之后通过记忆生成来对抗肿瘤抗原所面临的挑战，目前知之甚少。

因此，深入探究针对肿瘤抗原逃逸变异体反应发展背后的复杂免疫学机制和细胞相互作用势在必行。这些知识对于设计靶向疗法以支持免疫系统管理和控制不断演变的肿瘤变异体至关重要。使用表达由X连锁基因Trap1a编码的癌-睾丸自身抗原P1A的肿瘤模型（类似于人类癌-睾丸同源物如MAGE），我们发现了一个独特的肿瘤局部现象，即CD8⁺T细胞在激活NK细胞中扮演重要角色。本研究旨在探究稳态免疫预激（priming）的生物学意义以及CD8⁺T淋巴细胞与NK细胞相互作用的机制，以提供针对肿瘤抗原逃逸变异体的有效免疫监视。结果表明，先发性的过继性T细胞转移不仅能预防肿瘤发展，还能通过引发涉及CD8⁺T和NK细胞的协同效应程序来驱动对 emerging 抗原逃逸变异体的完全排斥。

2 Materials and methods

（此部分详细描述了实验材料与方法，包括小鼠模型、细胞系、肿瘤建立、T细胞过继转移与动物成像、树突状细胞分化与T细胞活化、细胞毒性 assay、T细胞增殖 assay、CD8⁺T-NK细胞共培养、活细胞2D和3D成像与共定位分析、免疫荧光染色、流式细胞术评估蛋白及磷酸化蛋白、硅学数据库分析以及统计学分析。具体实验步骤和条件请参阅原文。）

3 Results

3.1 The pre-tumor adoptive T cell transfer in mice enables preemptive immunosurveillance against tumor development and antigen escape

为研究肿瘤特异性CD8⁺T细胞在小鼠体内的命运，建立了针对表达癌-睾丸抗原P1A的P511肿瘤的T细胞过继转移方案。在肿瘤前稳态方案（D_?7）中，我们在皮下注射肿瘤前7天用5x10⁶个对H-2L^d:P1A_35-43特异的CD8⁺T细胞（TCRP1A CD8⁺T）重建Rag1^?/?B10.D2小鼠，并与肿瘤后方案（D₊₁，即肿瘤注射后一天转移相同数量的T细胞）进行比较。与D₊₁方案的结果形成鲜明对比的是，肿瘤前D_?7 TCRP1A CD8⁺T细胞转移方案完全阻止了P511肿瘤细胞的生长，并在所有小鼠中提供了长期生存，且无肿瘤复发迹象。有趣的是，D_?7方案的实验条件消除了肿瘤逃逸突变体的生长，而D₊₁方案则不然。在肿瘤后D₊₁方案中，尽管其中位生存期相对于注射了P1A缺陷型P1.204肿瘤并接受D_?7或D₊₁方案T细胞的小鼠有所延长，但大多数小鼠仍死于P511肿瘤。这表明D₊₁方案在消除肿瘤注射部位出现的逃逸突变体方面存在控制失败，导致小鼠在肿瘤排斥3-4周后复发，大多数动物在35至70天内死亡。相比之下，在肿瘤前D_?7方案中，所有小鼠均存活且无肿瘤逃逸。

检查P511变异体的性质显示，在Rag1^?/?B10.D2小鼠中，D₊₁ TCRP1A CD8⁺T细胞转移后第25天逃逸的肿瘤细胞对TCRP1A CD8⁺T细胞介导的特异性裂解不敏感，而未接受T细胞转移的小鼠中收获的肿瘤细胞则敏感。此外，在第25天，这些逃逸细胞在TCRP1A Rag1^?/?B10.D2转基因小鼠中不受限制地生长，而未接受T细胞转移的肿瘤则被排斥。由于在逃逸肿瘤细胞上未检测到MHC class-I、共刺激分子B7.1或B7.2或粘附分子LFA-1或ICAM-1的下调，这表明抗原呈递过程完整，但P1A肿瘤抗原表达丢失。

3.2 Both direct and cross-antigen presentation effectively trigger the response of TCRP1A CD8⁺T cells against P1A⁺ tumors

研究调查了肿瘤细胞抗原的直接或交叉呈递对宿主抗原呈递细胞（APC）激活T细胞的影响。用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）染料标记的初始TCRP1A CD8⁺T细胞与不同浓度的辐照肿瘤细胞联合培养，并加入或不加入同系树突状细胞（DC）。研究发现，在没有DC的情况下，肿瘤细胞直接呈递P1A抗原与有DC培养时一样有效，都能触发T细胞增殖。从两种条件下收获的TCRP1A CD8⁺T细胞对P1A⁺靶标表现出相同水平的细胞毒活性，表明直接或交叉呈递的结果没有质量差异。为在体内测试这一点，我们将P511肿瘤细胞注射到异基因Rag1^?/?B6小鼠中。在这些小鼠中，缺乏同系APC只允许肿瘤细胞直接呈递P1A，而在同系Rag1^?/?B10.D2小鼠中，肿瘤细胞直接呈递和宿主APC交叉呈递均可发生。有趣的是，转移的TCRP1A CD8⁺T细胞在同基因或异基因小鼠的P1A⁺P511肿瘤引流淋巴结（TDLN）中显示出分裂细胞数量的增加，到第2天观察到至少6次分裂，尽管在Rag1^?/?B6小鼠中收获的T细胞数量可能由于FasL介导的凋亡导致的同种反应性外周删除而较低。我们测试了异基因DC通过 trogocytosis 进行交叉修饰的可能性，但试图在与凋亡或坏死P1A⁺肿瘤共孵育的异基因宿主DC上检测L^d:P1A肽复合物的结果为阴性。这些结果表明，无需交叉呈递，肿瘤细胞直接呈递P1A抗原能有效诱导T细胞增殖并引发肿瘤特异性CD8⁺T细胞反应。

3.3 TCRP1A CD8⁺T lymphocytes detect and eliminate P1A-loss tumor variants through cooperative interactions with other immune cells

分析了转移前后TCRP1A CD8⁺T细胞的特征。尽管无法检查肿瘤前D_?7方案中已消除的肿瘤，但我们评估了过继转移T细胞的活化情况。在P511肿瘤注射后三天，来自D_?7或D₊₁方案的H2-L^d:P1A tetramer⁺ TCRP1A CD8⁺T细胞在肿瘤引流淋巴结（TDLN）和脾脏中维持等效水平的IL-2受体α链（CD25）和细胞内IFNγ表达，而在携带P1A^?P1.204肿瘤的小鼠中观察到不显著的表达。此外，在转移后第3天，TCRP1A CD8⁺T细胞在对照淋巴结（CLN）和脾脏中的频率和总数在D_–7和D₊₁组间具有可比性，在D₊₁组TDLN中观察到频率有降低趋势。到第25天，在D₊₁方案小鼠中，效应记忆CD44^highCD62L^low细胞（T_EM）在TDLN和CLN中的比例分别比D_?7方案中观察到的比例高约2倍。D₊₁方案中的TCRP1A CD8⁺T细胞在CLN中也显示出 predominantly 更高比例的具有中央记忆细胞（T_CM）特征的CD44^highCD62L^high表型。这些记忆样群体在P1A^?P1.204肿瘤中可忽略不计。尽管D₊₁组具有更高的记忆表型，但D_-7和D₊₁方案在匹配的效应靶比（E:T）下对P1A⁺靶标表现出相似的细胞毒活性。这些结果表明，D_–7方案中的肿瘤消除并不仅仅依赖于T细胞记忆分化，还可能涉及由最佳时机和稳态协同相互作用与其他免疫细胞群体促进的早期清除。相反，D₊₁组中持续的抗原暴露不仅可能促进效应记忆T细胞的扩增，还可能加剧免疫耗竭。此外，D₊₁方案中持续的效应器活性带来的免疫选择压力可能导致表现出P1A抗原丢失的肿瘤变异体的出现和生存。总之，这些发现强调了在D_–7T细胞转移方案下，非T细胞免疫成分在肿瘤完全清除中的协作作用。

3.4 Granzyme B–expressing NK cells, in concert with preemptive adoptive T cells, mediate the elimination of tumor escape variants

进一步评估了先发性T细胞转移带来的完全肿瘤消除和对肿瘤逃逸的遏制是由于诱导适应性反应后的旁观者效应还是由与其他免疫细胞的替代相互作用介导的其他机制。我们在同一只Rag1^?/?或Rag1^?/?γc^?/?小鼠的对侧腹壁建立P1A⁺P511和P1A^?P1.204肿瘤。基于先前建立的动力学，在D_?5进行TCRP1A CD8⁺T细胞转移仅导致Rag1^?/?和Rag1^?/?γc^?/?小鼠对侧腹壁的P1A⁺P511肿瘤被排斥，而非P1A^?肿瘤。然而，当P511和P1.204肿瘤在同一部位建立时，D_?5转移的TCRP1A CD8⁺T细胞在Rag1^?/?而非Rag1^?/?γc^?/?小鼠中排斥了P1A^?P1.204肿瘤。此外，单独注射的P511肿瘤或与P1.204变异体共同注射在右侧腹壁均未显示可测量的随时间生长，表明存在有效的免疫反应。值得注意的是，通过施用抗NK1.1抗体耗竭NK细胞导致P1.204肿瘤生长增强，支持了NK细胞在控制抗原逃逸中的作用。

此外，追踪的TCRP1A CD8⁺T细胞在第2天出现在Rag1^?/?小鼠的LN和脾脏中，增殖很少，而在Rag1^?/?γc^?/?小鼠的外周血（PBL）、脾脏、肝脏和肺中显示出 vigorous 增殖。五天后，TCRP1A CD8⁺T细胞在Rag1^?/?γc^?/?小鼠的PBL（65%）、脾脏（40%）、肝脏（40%）和肺（10%）中占主要比例，未检测到NK细胞。相比之下，转移的T细胞在Rag1^?/?小鼠中第5天在PBL或脾脏中占比<3%，在LN中约占25%，所有组织中均有显著比例的NK细胞（在LN和PBL中>50%）。尽管有广泛的NK细胞分布，但未接受转移T细胞的Rag1^?/?小鼠并未排斥混合的P1A⁺和P1A^?肿瘤。此外，接受了TCRP1A CD8⁺T细胞转移的NK细胞缺陷型Rag1^?/?γc^?/?小鼠未能排斥P1A^?P1.204肿瘤。混合肿瘤细胞仅在接受了D_?5 TCRP1A CD8⁺T细胞转移的NK细胞充足的Rag1^?/?小鼠中被排斥。总之，这些结果说明，无论是CD8⁺T细胞还是NK细胞，单独都不具备根除抗原缺陷型肿瘤的能力。相反，它们的协同相互作用对于成功排斥肿瘤抗原逃逸变异体至关重要，强调了T-NK细胞对话在异质性肿瘤细胞免疫监视中的相互作用。

因此，我们对内源性NK细胞与转移的TCRP1A CD8⁺T细胞在Rag1^?/?和Rag1^?/? GzmB-Tom小鼠的P1A⁺P511肿瘤中的细胞相互作用和颗粒酶B（GzmB）表达进行了成像。确实，NK细胞与转移的TCRP1A CD8⁺T细胞共定位，并表现出与GzmB相对应的内源性番茄荧光，其强度显著高于没有TCRP1A CD8⁺T相互作用的NK细胞，且在肿瘤中高于肿瘤引流LN。因此，在不依赖TCRP1A CD8⁺T细胞细胞毒性旁观者效应来消除抗原缺陷型肿瘤变异体的情况下，与肿瘤浸润CD8⁺T细胞共存的NK细胞通过增强的GzmB表达来阻止肿瘤建立和抗原逃逸。此外，在体内模型中观察到的GzmB表达增加可能与CD8⁺T细胞或NK细胞中表达的NKG2D配体水平无直接相关性，而是反映了肿瘤微环境内免疫相互作用导致的更广泛的NKG2D不相关的NK细胞活化谱。这些发现表明，CD8⁺T细胞与NK细胞之间的通讯和相互作用在清除 emerging 免疫逃逸肿瘤变异体中扮演着关键角色。

3.5 Antitumoral CD8⁺T?NK cell crosstalk relies on pseudopodial intercellular membrane fragment exchange

为研究CD8⁺T细胞与NK细胞之间突触相互作用的物理和功能动力学及其对抗肿瘤免疫监视的影响，我们使用共聚焦激光扫描显微镜分析了细胞-细胞接触和运动行为。由于淋巴细胞固有的高运动性，体外成像其相互作用具有技术挑战性。为克服这一点，我们开发了一种三维（3D）网状纳米纤维二氧化硅毯，其纤维密度范围从标准区域的每100 μm2 25根纤维到5×5模具区域的每100 μm2 4根纤维，且纤维直径更大。这模拟了疏松结缔组织（包括淋巴组织）中富含胶原III的细胞外基质（ECM）环境的密度和拓扑结构。在这些3D条件下，我们观察到CD8⁺T（绿色）和NK细胞（红色）之间的直接相互作用和膜片段交换。然而，由于致密基质的有限光学可达性，我们使用纤连蛋白的2D基底条件作为补充，允许高分辨率成像和量化细胞间接触事件。

在这些实验中，NK细胞用亲脂性长链二烷基碳菁追踪剂DiD（紫色）标记，CD8⁺T细胞用胆固醇结合laurdan（红色）标记。标记的CD8⁺T和NK细胞接种到纤连蛋白预包被的板上，呈现圆形并随机移动或保持固定。然而，当彼此接近（直接接触）时，NK细胞也形成细胞间膜纳米管，伴随着显著的伪足内陷和突起，允许膜片段从CD8⁺T向NK细胞转移，这在延时成像中很明显，反之亦然从NK向T细胞转移。

为量化CD8⁺T-NK细胞共定位的动态，我们将延时视频分割成100帧并应用时空建模。使用它们各自的荧光轮廓定义细胞边界，并随时间追踪细胞间 proximity 和 centroid 位移。我们使用速度-距离指数（SDI）计算相互作用强度，其定义为细胞速度和细胞间距离的函数。CD8⁺T-NK细胞对表现出显著更高的SDI值，相对于其他相互作用，表明定向迁移和稳定接触，这是免疫突触形成的特征。此外，按距离分布的共定位频率的双峰分布表明CD8⁺T细胞向NK细胞的定向吸引。然后我们量化了每种细胞类型内的洋红色荧光，揭示了CD8⁺T和NK细胞之间可测量的信号交换，进一步支持了相互作用过程中的膜转移。

此外，为评估CD8⁺T细胞与NK细胞相互作用的动力学，我们追踪了单个CD8⁺T细胞在三个不同动力学阶段的运动：接触前（Ph1）、接触期间（Ph2）和分离后（Ph3）。细胞在与NK细胞接触时减速，随后在分离后加速。这种动力学模式使用减速比（Ph2/Ph1）进行量化，累积分析显示超过70%的CD8⁺T细胞在接触期间速度降低了≥5倍，这与稳定的免疫突触形成以维持持续的突触接合和信号传导一致。

最后，为探索这种相互作用的功能后果，我们评估了激活受体或分子是否可以在细胞间转移。将用荧光染料偶联的CD25和CD69抗体标记的初始或活化CD8⁺T细胞与未标记的初始NK细胞共孵育。流式细胞术分析显示，在20分钟时有一小部分（约1%）CD69⁺CD25⁺ NK细胞，到24小时增加至6-8%。相反，当使用初始CD8⁺T细胞时未观察到此类转移。因此，CD8⁺T-NK细胞对话通过伪足隧道纳米管样结构发生，使得 trogocytosis 和激活膜受体片段从活化CD8⁺T细胞向初始NK细胞的定向转移成为可能。尽管这些结果未考虑CD25或CD69分子的任何转录贡献，但它们证明抗肿瘤CD8⁺T-NK相互作用参与了动态、极化的伪足纳米管样结构，通过 trogocytosis 促进双向激活膜受体交换。这种交换不仅反映了物理接触，还支持了对细胞激活 machinery 至关重要的功能分子的转移。

3.6 Receptor–ligand interactions during CD8⁺T?NK cell crosstalk are essential for regulating effector mechanisms and promoting memory cell formation

为更深入理解CD8⁺T与NK细胞对抗肿瘤变异体的协作机制，我们分析了可能在其激活和效应功能中扮演角色的受体-配体接合、细胞因子和下游分子。我们建立了由等量活化CD69^highCD25^high (≥ 90%) CD8⁺T细胞（活化CD8⁺T, 0.5 x 10⁶）和初始CD49b⁺ (DX5⁺) NK细胞（初始NK, 0.5 x 10⁶）组成的共培养体系，置于纤连蛋白预包被的板中。

共培养24小时后，活化CD8⁺T细胞抑制了可诱导的IL-2受体α链（CD25）表达，但不抑制组成型β链（CD122）和γ链（CD132）或CD69的表达。另一方面，NK细胞在共培养后上调了CD25、CD132和CD69，与单独培养相比不影响CD122。根据7-AAD测量，单独培养或共培养中的CD8⁺T细胞和NK细胞均未显示细胞死亡增加。此外，尽管CD25减少但CD122和CD132链未减少，CD8⁺T细胞显示对重组IL-2/Fc嵌合蛋白的捕获增加。相比之下，NK细胞在捕获的IL-2/Fc蛋白上未显示任何变化。共培养 versus 单独培养条件下细胞内细胞因子表达的 fold-change 分析显示，当与活化CD8⁺T细胞共培养时，具有增加的IL-2、IFN-γ和IL-4相对表达以及更高IFN-γ/IL-4比率的NK细胞（红条）频率更高。值得注意的是，IL-15Rα表面表达增加，尽管在共培养后两种细胞类型间具有可比性，表明细胞因子水平发生了转变。这表明CD8