鄱阳湖流域Kovacikia属两新种（不产叶绿素f）的发现及其对蓝细菌系统演化与光适应机制的启示

本研究首次报道了来自中国鄱阳湖流域土壤生境的Kovacikia属两新种——K. diezihuensis和K. jiangxiensis（Leptolyngbyaceae, Leptolyngbyales）。通过多相分类法（含16S rRNA基因系统发育、ITS二级结构及形态学分析），证实其为不产叶绿素f（Chl f）的非远红光适应型物种。该发现揭示了同一属内同时存在产Chl f与不产Chl f物种的演化分异现象，为研究蓝细菌光合系统适应性进化及生态位分化提供了关键线索。

　　

1 引言

丝状蓝细菌中的Leptolyngbyales目是一个庞大且明显多系群，尽管其成员形态相似。传统上仅依靠形态特征对蓝细菌进行分类严重低估了其多样性。分子遗传学方法和电子显微镜的应用从根本上推动了蓝细菌分类的变革。例如，基于系统发育分析和类囊体超微结构模式，将Oscillatoriales修订为Oscillatoriales和Synechococcales，而Leptolyngbya被归入新科Leptolyngbyaceae（Synechococcales）。近年来，随着已鉴定蓝细菌参考菌株数量的增加和基因组序列的完善，Strunecky等人重建了 robust 的系统基因组树，将整个蓝细菌门分为10个新目和15个新科。因此，许多Leptolyngbya样蓝细菌不再属于Synechococcales，而是属于Leptolyngbyales（包括Leptolyngbyaceae、Trichocoleusaceae和Neosynechococaceae）、Oculatellales和Nodosilineales。

Leptolyngbya是一个较大且明显多系群，但仅凭形态特征几乎无法区分。近年来，结合生态、分子和形态数据的多相方法被广泛应用，为属和种水平的分类提供了更多证据。传统定义的Leptolyngbya实际上包括几个不同的、亲缘关系不近的系统发育簇，其中一些已通过多相方法正式鉴定为从Leptolyngbya分离出来的新属，如Phormidesmis、Tapinothrix、Alkalinema等。值得注意的是，上述蓝细菌中关于叶绿素f（Chl f）产生的研究相对较少。

Chl f是叶绿素家族的最新成员，是一种远红光（FRL）诱导的叶绿素。蓝细菌通过一种复杂而广泛的光适应反应（称为远红光光适应（FaRLiP））重组其光合装置并产生Chl f，大大提高了它们在FRL下的光合性能，并在FRL环境中作为初级生产者发挥重要的生态作用。目前已知Chl f仅存在于一些蓝细菌中，这些能产生Chl f的蓝细菌包括Halomicronema、Aphanocapsa、Chlorogloeopsis、Leptolyngbya、Calothrix、Fischerella、Synechococcus、Chroococcidiopsis、Altericista、“Leptothermofonsia”、Kovacikia、Elainella、Pegethrix和Leptodesmis。这表明产Chl f蓝细菌具有显著的多样性，值得进一步的分类学研究。最近，多相方法也逐渐应用于产Chl f蓝细菌的分类，并成功鉴定出一些新种。

2 材料与方法

2.1 菌株分离、纯化和保藏

本研究使用的样品分离自中国江西省南昌市碟子湖大道墙角竹林下的土壤、碟子湖大道墙角苔藓状土壤以及江西师范大学墙角的干燥蓬松土壤。这些是类似于FRL生境的阴暗环境。

将适量样品加入250 mL锥形瓶中的100 mL无菌BG11培养基，在25°C、5–10 μmol photons m^?2 s^?1的白光（WL）下培养直至出现培养物。然后将培养物匀浆以尽可能分散细胞，并使用稀释涂布平板法在0.8%固体BG11平板上进行纯化。最后，成功分离出单藻株并在BG11培养基中扩大培养。使用倒置显微镜测定分离菌株的纯度。纯菌株保存在含有120 mL BG11培养基的250 mL锥形瓶中，在WL下于鄱阳湖藻种保藏中心（ACCP）保藏。

2.2 PCR扩增和系统发育分析

使用改良的CTAB法提取蓝细菌基因组DNA。使用寡核苷酸引物PA和B23S扩增16S rRNA基因和完整的16S–23S rRNA内部转录间隔区（ITS）。PCR反应体系包含25 μL PCR Mix、2 μL正向和反向引物、2 μL DNA，并用无菌水补至50 μL。热循环条件设置为：95°C初始变性5分钟；95°C变性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸2分钟30秒，共35个循环；最后72°C延伸10分钟。通过电泳检测PCR产物并回收。将回收产物与pMD? 18-T载体连接，然后转染至感受态大肠杆菌细胞。最后，对阳性单克隆进行测序。使用BioEdit软件处理序列并上传至NCBI GenBank。

使用BioEdit对16S rRNA基因序列进行比对。采用ModelFinder估计的Akaike信息准则（AIC）下的最佳模型分别进行贝叶斯推断（BI）和最大似然（ML）分析。使用MrBayes和IQ-TREE分别估计BI和ML的替代模型参数。对于BI分析，运行两个独立的四个马尔可夫链，运行1000万代，每100代采样一次。进行1000次bootstrap重复以评估分支的相对支持度。对于ML系统发育树，进行1000次bootstrap重复以估计每个分支节点的置信度。还通过邻接（NJ）系统发育树分析了16S rRNA基因的系统发育关系。使用Gloeobacter violaceus PCC 7421作为外群。三种方法在给出bootstrap值的分支上产生了相同的系统发育图。使用FigTree可视化系统发育树。在贝叶斯系统发育树中显示了BI/ML/NJ方法大于70%的bootstrap值。使用MEGA计算16S rRNA基因的序列相似性。

2.3 ITS二级结构分析

使用BioEdit比对16S–23S rRNA序列以确定相似性和差异性百分比。16S–23S rRNA ITS区域序列也用于在物种水平上对调查菌株进行分类分辨率。将这些菌株的完整ITS序列与相应序列进行比对，并根据Iteman等人描述的方法鉴定不同的保守和可变区域。使用m-Fold网络服务器预测ITS区域的二级结构，例如D1–D1’、Box-B和V3螺旋，并单独折叠每个片段。本研究使用默认参数。

2.4 形态学和超微结构检查

将适量藻丝匀浆加入新鲜液体BG11培养基中，在25°C、5–10 μmol photons m^?2 s^?1的WL下培养约两周。使用尼康Eclipse 80i光学显微镜检查培养物。从至少10个不同藻丝中获取至少100个细胞长度和宽度的测量值。使用尼康D5600数码相机记录菌落形态。根据先前描述的方法使用透射电子显微镜（TEM）检查亚细胞超微结构。

2.5 新分离株的色素组成

使用积分球紫外（UV）分光光度计在400–800 nm范围内分析培养良好的藻丝的吸收光谱，包括蓝细菌培养物、脂溶性色素和水溶性色素。所有操作均在昏暗或黑暗条件下进行。使用磷酸盐缓冲液提取水溶性色素。使用甲醇提取脂溶性色素。将藻体在4°C、13,200 g下离心2分钟，去除上清液，保留藻 pellet。加入50%甲醇，混合样品，离心后去除上清液。加入预冷（-20°C）的100%甲醇，藻在-20°C提取过夜。在4°C、13,200 g离心2分钟后，收集上清液用于脂溶性色素吸收光谱分析。

3 结果

3.1 系统发育评估

获得了K. diezihuensis ACCP0342和K. jiangxiensis ACCP0444的16S rRNA基因部分序列。基于16S rRNA基因序列的系统发育树包含84个核苷酸序列，最终数据集共有1,185个核苷酸位置，进一步揭示了这两个菌株与其姊妹分类群之间的系统发育关系。从基于16S rRNA基因序列的系统发育树来看，ACCP0342、ACCP0444、K. muscicola、K. minuta、“Leptothermofonsia sichuanensis”、K. anagnostidisii、K. brockii和K. atmophytica聚集在一个群中，并归属于Kovacikia属，而其他姊妹分类群Chroakolemma、Pantanalinema和Stenomitos在属水平上明显分离成独立的谱系。Leptothermofonsia Daroch, Tang and Shah 2022被并入Kovacikia Miscoe, Pietrasiak and Johansen 2016，而由于全指定不当，Leptothermofonsia不被视为有效名称。因此，“L. sichuanensis”的序列仅用作Kovacikia属的背景参考。

比较K. diezihuensis（1,481 bp）和K. jiangxiensis（1,482 bp）的16S rRNA基因序列，相似性为97.2%。16S rRNA基因序列相似性为98.7%或更低的蓝细菌可被视为不同物种。与K. minuta相比，ACCP0342和ACCP0444的16S rRNA基因序列相似性分别为96.8%和95.7%。K. diezihuensis和K. jiangxiensis的16S rRNA基因序列与其他五种Kovacikia物种的相似性为94.9%–96.8%，表明它们是同一属内的不同物种。

3.2 16S-23S ITS分析

ACCP0342和ACCP0444菌株的16S–23S rRNA ITS序列长度分别为493 bp和488 bp，分别具有两种tRNA：tRNA^Ile（74 bp）和tRNA^Ala（73 bp）。五种代表性菌株的16S–23S rRNA ITS序列完整，长度分别为617、610、550、519和602 bp。16S–23S rRNA ITS区域的百分比差异已被证明在建立蓝细菌物种方面非常有效。与K. minuta相比，ACCP0342和ACCP0444的16S-23S ITS序列相似性分别为38.9%和38.2%。ACCP0342和ACCP0444菌株的16S–23S rRNA ITS序列彼此之间有10.6%的差异，与其他五种Kovacikia物种有33.9%至38.9%的差异，这符合不同物种的阈值。

代表性区域16S–23S rRNA ITS（即D1–D1’、Box-B和V3螺旋）的二级结构如图所示。ACCP0342和ACCP0444菌株的D1–D1’螺旋长度相似，为62个核苷酸。所有菌株都有一个基干（GACCU-AGGUC），D1–D1’螺旋的中下部分差异很小。主要差异集中在顶部，ACCP0342和ACCP0444之间仅三个核苷酸不同。

Box-B螺旋的长度为37–47个核苷酸。关于Box-B螺旋的长度，ACCP0342最短，为37个核苷酸，ACCP0444为41个核苷酸，与K. muscicola HA7619-LM3 clone 41A和K. atmophytica BACA0619相同。Box-B螺旋在底部部分（AGCA-UGCU）部分相同，在上部差异较大，尤其是在顶部。

V3螺旋在长度（范围40–110个核苷酸）和二级结构构象上整体变化很大。K. anagnostidisii YS86-RH1中缺少V3螺旋。K. anagnostidisii YS86-RH1的V3区域不完整，包含88个核苷酸，其尾部缺失，导致无法形成稳定的螺旋结构。ACCP0342的V3螺旋与ACCP0444最相似；两者都很短，长度分别为40和41个核苷酸，仅有五个碱基差异，且集中在顶部。所有V3螺旋具有相同的基干结构（GUCAGGU-ACAGAC），ACCP0342和ACCP0444的V3螺旋整体上与其他菌株非常不同。

总之，基于16S–23S rRNA ITS序列及其二级结构的差异，ACCP0342和ACCP0444表现出独特性，可区分为不同的物种。

3.3 形态描述

Kovacikia diezihuensis L.-Q. Shen & R. Li sp. nov.

诊断：其在WL下颜色为亮蓝绿色，这与其他Kovacikia物种不同。其16S rRNA基因序列与K. jiangxiensis ACCP0444的相似性为97.2%，与Kovacikia属其他五个物种的相似性为95.5%–96.8%。其在ITS区域具有独特的二级结构。

描述：在液体培养中，藻丝延伸并缠绕形成薄至稍厚的垫状，大部分附着在底部或小部分，并聚集在液体培养表面和接触瓶体处。在WL下颜色为亮蓝绿色。藻丝伸长，偶尔略微弯曲，无假分枝、异形胞和静息孢子。鞘无色，稍薄，偶尔可见。藻丝末端不渐细，在横壁处稍缩缩，偶尔有死细胞。细胞圆柱形，顶端细胞圆形，无帽状体；有时在细胞中心观察到小圆形颗粒。细胞等直径或长度略大于或略小于宽度，长度0.90–2.92 μm（平均1.67 μm），宽度1.46–2.21 μm（平均1.86 μm）。细胞有4-6层 parietal thylakoid membrane。通过藻殖段、藻丝通过死细胞断裂及随后解体，然后释放藻殖段进行繁殖。

词源：种加词“diezihuensis”指的是K. diezihuensis的采集地点，中国江西省南昌市碟子湖大道。

主模式：ACCP-ZLJX20210342，包含ACCP0342菌株的培养材料（保存在10 mL离心管的4%甲醛中）和同一菌株的干燥生物质（保存在2 mL冷冻储存管中），保藏于ACCP。

等模式：WZUH-ZLJX20210342，包含ACCP0001菌株的培养材料（保存在10 mL离心管的4%甲醛中）和同一菌株的干燥生物质（保存在2 mL冷冻储存管中），保藏于温州大学生命与环境科学学院。

参考菌株：ACCP0342。培养物保藏于ACCP。

生境和模式产地：该菌株分离自中国江西省南昌市碟子湖大道墙角竹林下的土壤（28°41′12.13″N, 115°50′06.57″E）。

其他菌株、生境和产地：菌株ACCP0340分离自中国江西省南昌市碟子湖大道墙角的苔藓状土壤（28°41′12.32″N, 115°50′05.56″E）。

Kovacikia jiangxiensis L.-Q. Shen & R. Li sp. nov.

诊断：其颜色为灰绿色至蓝绿色，且在WL下细胞长度通常大于宽度，这与其他Kovacikia物种不同。其16S rRNA基因序列与K. diezihuensis ACCP0342的相似性为97.2%，与Kovacikia属其他五个物种的相似性为94.9%–96.2%。其在ITS区域具有独特的二级结构。

描述：在液体培养中，藻丝延伸并缠绕形成薄至稍厚的垫状。小部分附着在底部，而大簇藻丝漂浮在液体培养表面。在WL下颜色为灰绿色至蓝绿色。藻丝伸长，偶尔略微弯曲，无假分枝、异形胞和静息孢子。鞘无色，稍薄，偶尔可见。藻丝末端不渐细，在横壁处稍缩缩，偶尔有死细胞。细胞圆柱形，顶端细胞圆形，无帽状体。细胞通常长度大于宽度，长1.11–2.92 μm（平均1.92 μm），宽0.96–1.49 μm（平均1.17 μm）。细胞有3-5层 parietal thylakoid membrane。通过藻殖段、藻丝通过死细胞断裂及随后解体，然后释放藻殖段进行繁殖。

词源：种加词“jiangxiensis”指的是K. jiangxiensis的采集地点，中国江西省南昌市江西师范大学。

主模式：ACCP-ZLJX20210444，包含ACCP0444菌株的培养材料（保存在10 mL离心管的4%甲醛中）和同一菌株的干燥生物质（保存在2 mL冷冻储存管中），保藏于ACCP。

等模式：WZUH-ZLJX20210444，包含ACCP0444菌株的培养材料（保存在10 mL离心管的4%甲醛中）和同一菌株的干燥生物质（保存在2 mL冷冻储存管中），保藏于温州大学生命与环境科学学院。

参考菌株：ACCP0444。培养物保藏于ACCP。

生境和模式产地：该菌株分离自中国江西省南昌市江西师范大学墙角的干燥蓬松土壤（28°41′0.786″N, 116°1′50.467″E）。

3.4 色素分析

ACCP0342和ACCP0444菌株在WL下的吸收光谱如图所示。通过细胞吸收光谱，色素主要包括Chl a、藻蓝蛋白（PC）和类胡萝卜素。水溶性色素分析表明，ACCP0342和ACCP0444菌株产生大量PC（在WL下吸收峰约618 nm），但不产生藻红蛋白（PE）。基于脂溶性色素的吸收光谱，ACCP0342和ACCP0444菌株产生Chl a（在甲醇中WL下吸收峰约667 nm）。这两个菌株不能在FRL诱导下产生红移复合物和Chl f，也不能在FRL下生长。

4 讨论

根据先前报道，Kovacikia的物种分布广泛，发现于中国江西省、湖北省和四川省；横跨欧亚大陆至大西洋的亚速尔群岛（葡萄牙），以及北美的黄石国家公园（美国）和太平洋的夏威夷群岛，横跨整个北半球，且均位于中纬度地带。尽管它们地理分布遥远，但它们在不同生境中繁殖的能力，包括淡水、气生环境附生于植物下、洞穴墙壁、土壤表面和温泉，反映了它们对不同条件的强大适应性。这些物种是形成垫状群、微生物垫、苔藓或结皮的藻丝，这可能有助于它们适应环境变化。此外，Kovacikia物种分布广泛且生境多样，很可能是环境中普遍存在的一类蓝细菌。

Kovacikia最初通过多相方法被鉴定为一个新属，其主要由其独特的系统发育位置和ITS区域的二级结构定义。分子遗传学方法常用于多相方法，在现代蓝细菌分类中至关重要。在本研究中，系统发育分析表明它们与其他五种Kovacikia物种聚集在Kovacikia属中。比较16S rRNA基因序列，K. diezihuensis、K. jiangxiensis与其他五种Kovacikia物种的相似性为94.9%–97.2%，这属于同一属内不同物种的适当阈值。与其他Kovacikia物种相比，K. diezihuensis和K. jiangxiensis的ITS区域二级结构表现出显著差异，证明了它们的独特性。所有这些分子遗传学数据支持将K. diezihuensis和K. jiangxiensis与其他五种Kovacikia物种区分开来。

实际上，Kovacikia在形态上被认为与Leptolyngbya相似，难以区分。在本研究中，K. diezihuensis与其他Kovacikia物种最明显的形态差异是其颜色为亮蓝绿色。相比之下，其他物种在WL下呈紫褐色或灰绿色至蓝绿色。其次，其细胞长度略小于平均宽度，这与K. anagnostidisii相似。K. jiangxiensis在形态特征上与K. atmophytica最相似，但仍存在细微差异，即其细胞宽度稍小。K. jiangxiensis在颜色或细胞长宽比上与其他Kovacikia物种不同。因此，两个新种K. diezihuensis和K. jiangxiensis在形态上与其他五种Kovacikia物种相似。同时，它们在颜色和细胞长宽比上有细微区别。

在五种正式报道和有效命名的Kovacikia物种中，只有K. minuta被报道产生Chl f。“Leptothermofonsia”被并入Kovacikia，而由于全指定不当，“Leptothermofonsia”不被视为有效名称。然而，“L. sichuanensis” E412，一种Kovacikia菌株，也可以在FRL下生长，且颜色为绿色。结合基因组数据，推测该菌株也具有产生Chl f的能力。在生境方面，K. minuta分离自遮荫池塘大型植物下的菌落，“L. sichuanensis” E412分离自莲花湖温泉池塘的菌落，而本研究中的K. diezihuensis和K. jiangxiensis分离自墙角的苔藓状土壤。这些生境是产Chl f蓝细菌的常见生境，表明产Chl f蓝细菌和非产Chl f蓝细菌之间可能存在生态位重叠。Ohkubo和Miyashita的结果表明，微生物垫的深层是产Chl f蓝细菌的生境，Chl f使它们能够在缺乏PAR的生境中生存。因此，在微生物垫或菌落中，非产Chl f蓝细菌可能更靠近WL，而产Chl f蓝细菌更靠近FRL。

在分子遗传学方面，系统发育树显示它们聚集在Kovacikia属中。本研究中不产Chl f的K. diezihuensis和K. jiangxiensis在物种水平上与K. minuta和“L. sichuanensis” E412分化，并且16S rRNA基因序列相似性为95.0%–96.8%。此外，ITS区域的二级结构和ITS序列表现出显著差异，证明了它们的独特性。所有这些表明在Kovacikia中，同一属内同时存在产Chl f和不产Chl f的物种。这为进一步分析产Chl f蓝细菌的进化分异及其对不同环境的适应性提供了重要动力。

与K. diezihuensis相比，在形态上，K. jiangxiensis与K. minuta和“L. sichuanensis” E412更相似，两者都具有细长细胞。在Kovacikia中，产生Chl f并含有PE的K. minuta和“L. sichuanensis” E412在WL下呈棕色或紫褐色，在FRL下呈草绿色或绿色。然而，不产生Chl f且不含PE的K. diezihuensis和K. jiangxiensis在WL下呈亮蓝绿色或蓝绿色至灰绿色。推测含有PE的K. muscicola也可能具有产生Chl f的能力。在已报道的产生Chl f的Leptolyngbya样蓝细菌中，发现除Leptodesmis undulata外，所有其他蓝细菌都含有藻红蛋白。因此，Chl f可能更容易在含有藻红蛋白的Leptolyngbya样蓝细菌中发现。

5 结论

总之，通过结合生态、分子和形态数据的多相方法，将三种Leptolyngbya样蓝细菌在系统发育上鉴定为K. diezihuensis sp. nov.（参考菌株ACCP0342）和K. jiangxiensis sp. nov.（参考菌株ACCP0444）（Leptolyngbyaceae, Leptolyngbyales）。这两个Kovacikia新种在WL下不产生藻红蛋白，在FRL诱导下不产生Chl f。这是首次在Leptolyngbyales目内同一属中同时报道产Chl f和不产Chl f的物种，揭示了产Chl f蓝细菌的多样性及其进化分异。

此外，它们的生境是产Chl f蓝细菌的常见生境，表明产Chl f蓝细菌和非产Chl f蓝细菌之间可能存在生态位重叠。在已报道的产生Chl f的Leptolyngbya样蓝细菌中，发现除Leptodesmis undulata外，所有其他蓝细菌都含有藻红蛋白。因此，推测Chl f可能更容易在含有藻红蛋白的Leptolyngbya样蓝细菌中发现。这些发现有助于阐明蓝细菌中FaRLiP的进化，并为未来具有FaRLiP基因簇的Chl f蓝细菌的生态应用提供新的视角。